Как открыть хостел | HowToHostel Как открыть хостел … 
Пирамида особого вида. Россияне теряют миллионы в кредитных кооперативах
Какие ещё есть претензии к КПК и что делать россиянам
Кооператив — это такая интересная форма, когда пайщик принимает на себя некоторые обязательства, обращают внимание опрошенные «Секретом» эксперты.
«По идее, это некоммерческая организация — и не банк, и не МФО. Прежде чем вступать в кооператив, нужно внимательно изучить закон о потребительской кооперации и уставные документы КПК. Но многие, доверяя рекламе о высоких процентах и гарантированном доходе в условиях постоянно снижающегося уровня жизни, забывают о рисках и нюансах», — сказала Евгения Лазарева.
В качестве примера она приводит город Камышин в Волгоградской области, где при банкротстве кооператива финансовый управляющий выставил всем членам кооператива требование доплатить, чтобы залатать финансовую дыру. Естественно, никто из пайщиков не был к такому готов. Но управляющий действовал в рамках закона.
О ситуации с камышинским КПК «Честь» подробно рассказывало издание «Блокнот». Оно обратило внимание на то, что на имя умершей местной жительницы пришла копия судебного приказа, который вынесли на основании искового заявления этой организации. С умершей требовали дополнительные взносы за 2015 и 2017 годы, а также стабилизационный взнос за 2019 год.
В качестве существенного преимущества КПК Александр Цыганов называет возможность, пусть и далеко не всегда реализуемую, каждому члену-пайщику участвовать в управлении, контролировать процесс кредитования и привлечения новых членов.
«Но если КПК создан и жестко контролируется одним или несколькими «собственниками», то следует ожидать проблем. Среди них — нет защиты в АСВ, а по условиям коммерческого страхования в небольших страховых компаниях или ОВС практически никогда не будет страховых выплат. Всегда есть вероятность того, что КПК разорится, а вкладчику придется самостоятельно решать свои проблемы», — указал он.
Среди проблем эксперт также называет высокие проценты по займам и низкий уровень финансовой грамотности у заёмщиков, которые готовы брать займы на таких условиях. Вероятность распределения не дохода, а убытков по итогам года.
«Законодательство позволяет бенефициарным владельцам КПК достаточно долго морочить голову членам КПК и, например, переводить обязательства из одного КПК в другой, чтобы не возникло достаточного для возбуждения уголовного дела количества пострадавших граждан. А в случае банкротства КПК пока нет норм, позволяющих привлечь к субсидиарной ответственности учредителей и менеджмент КПК, недостаточен пока и надзор со стороны регулятора, хотя это постепенно исправляется», — сказал Цыганов.
Отдельный вопрос у опрошенных «Секретом» экспертов вызывает финансовая модель управления и устойчивости кооператива. Если КПК лопнул или деньги были инвестированы в прогоревшие затем проекты, формально спроса с руководства нет.
«В практике правоприменения известны случаи, когда пайщики на вполне законных основаниях должны были доплатить, чтобы сохранить устойчивость кооператива. Но когда КПК лопнул, пайщику совершенно безразлично, умышленно вкладывалось руководство кооператива «не туда» или не умышленно. Вернуть вложенные средства вряд ли удастся», — указала Евгения Лазарева.
Обезопасить себя на этом рынке потребитель может только тогда, когда не станет туда заходить без соответствующей базы знаний и чёткого понимания всех рисков, сходятся во мнении опрошенные «Секретом» эксперты. «Мошенники на этом рынке даже не особенно стараются — достаточно дать рекламу о выгодных вложениях в высокомаржинальные проекты, и люди сами будут нести последние деньги, сбережения или заёмные, чтобы получить побольше», — сетует Евгения Лазарева.
Как отличить КПК от финансовой пирамиды. Инструкция
Проверить название кооператива (на сайте налоговой). В документах не должны фигурировать ИП, ОАО или другие формы организаций, указывает независимый финансовый советник Александра Базак. Только КПК — иначе организация не является кооперативом.
Найти кооператив в реестре Центробанка. Регулятор заносит в свой список все легально работающие кредитные потребительские кооперативы.
Проверить членство в саморегулируемой организации. Все кооперативы должны состоять в саморегулируемой организации (СРО) и отчислять туда средства, указывает Александра Базак.
Фото: depositphotos.com
Может ли кредитный потребительский кооператив предложить «сверхвыгодный вклад»: поясняет Банк России
Если видите рекламу с яркими лозунгами «50% годовых по вкладам в КПК!» — не спешите нести этой организации деньги. Это явный обман. Проценты в кредитных потребительских кооперативах (КПК), возможно, и выше банковских, но не в несколько раз.
Кооператив объединяет физических или юридических лиц по какому-то признаку для взаимной финансовой помощи. Люди или компании одного региона, профессии, рода деятельности, социального статуса объединяются, чтобы самим решать свои финансовые задачи. КПК будут интересны особенно тем, кто живет в маленьком городке или селе, где нет отделений банков.
Контролирует их работу Банк России. Он установил Базовый стандарт для кооператива — так называемый свод правил, который, в частности, ограничивает доходность вложений: она не может превышать действующую ключевую ставку Банка России, умноженную на два. На 13 сентября 2021 года ключевая ставка равна 6,75% — значит, КПК не могут предложить доходность выше 13,5% годовых.Поэтому агрессивная манящая реклама «со сверхприбылью» может указывать на то, что под именем КПК работают мошенники.
Как же проверить кооператив на надежность?
Сверяем название. Юридическая форма организации должна быть «Кредитный потребительский кооператив» или «Сельскохозяйственный кредитный потребительский кооператив» (СКПК). Все остальные формы — ООО, ОАО, ЗАО, ИП — не имеют к КПК и СКПК никакого отношения. Если увидите название типа ООО «Кредитный потребительский кооператив» или ЗАО «Приобретательский кредитный кооператив», знайте: перед вами мошенники. При этом следует всегда смотреть на расшифровку аббревиатуры КПК или СКПК, за которой также могут скрываться мошенники, например, «Кредитный производственный кооператив» или «Сельскохозяйственный кредитно-производственный кооператив». Так мошенники пытаются ввести граждан в заблуждение.
Далее заглядываем в реестр. Зайдите на сайт Банка России и в разделе «Реестры» найдите выбранный вами кооператив. Сверьте данные государственного реестра с реквизитами КПК: полное название, ИНН, ОГРН должны совпадать. Для подстраховки зайдите на сайт саморегулируемой организации КПК и найдите этот кооператив там.
И, конечно, не верьте громкой рекламе. Например, если пайщиков уверяют, что их сбережения в «КПК» застрахованы государством, это обман. Государство
страхует лишь банковские вклады. КПК может самостоятельно застраховать взносы пайщиков, но лишь в страховых компаниях.
И самое важное при обращении с деньгами: читайте договоры. Передаете ли вы кому-то деньги или одалживаете — все условия должны быть четко прописаны.
Кредитно-потребительские кооперативы в Санкт-Петербурге
Посмотреть случаи по темеАвтор: Толстикова Дарья Константиновна
Одна из актуальных проблем граждан, которые хотели выгодно инвестировать накопленные денежные средства — сотрудничество с ненадежными поставщиками финансовых услуг, к которым относятся и так называемые кредитно-потребительские кооперативы (КПК).
Принцип финансовой пирамиды всегда одинаков: клиентов заманивают высокими процентами по вкладам, исправно производят первые выплаты, заручившись доверием клиентов, максимально наращивают объем инвестиций — и банкротятся, оставляя вкладчиков ни с чем.
Основные признаки финансовой пирамиды
Несмотря на то, что проблема финансовых пирамид не нова, люди снова и снова попадают в ловушку мошенников, поэтому очень важно обозначить основные признаки, выдающие недобросовестного игрока. В числе таких признаков:
- декларирующая уникальное предложение, агрессивная реклама, обещание высокой доходности;
- привлечение средств граждан для реализации программ с расплывчатыми формулировками сути деятельности;
- недавний срок регистрации компании, нередко — совмещение в одном лице учредителя и руководителя;
- отсутствие (или номинальность) постоянного офиса;
- возможность дистанционного заключения договора, «креативные» формы документа — например, не используемый в практике серьезных финучреждений «договор целевого финансирования».
При более глубокой проверке, как правило, выясняется, что уставной капитал компании минимален, в уставных документах — путаница, а лицензия на финансовую деятельность отсутствует.
Примеры КПК, действующих в СПб
На основании участившихся обращений граждан сегодня можно говорить о нескольких кредитно-потребительских кооперативах с признаками финансовой пирамиды, а именно:
|
Название КПК |
Чем привлекали клиентов |
|
«Инновационная земельная компания» (другие названия ГК «Инновации», ООО «Инземком») |
Закупка земель сельхозназначения, благоустройство приобретенных территорий и перевод их в категорию ИЖС, обещание — до 60% годовых |
|
«ПРОМЭКОНОМГРУПП» |
Рекламная информация о страховании вкладов, дающая основание полагать, что деньги вкладчиков защищены на случай банкротства организации, обещание — высокие проценты + «пассивный» доход |
|
ООО «Автоград»
|
деятельность контролировалась ЦБ и СРО «Мир», имелась страховка от предпринимательских рисков и индивидуальная страховка займов (компания «РосМед») |
На данный момент все три КПК перестали выплачивать проценты и не возвращают клиентам взносы (вклады, паи).
Как противостоять мошенническому КПК
Оказавшись в подобной ситуации (даже если лично вы еще не столкнулись с проблемой, но уже слышали о ней), необходимо действовать очень быстро и грамотно. Первый шаг — претензия о возврате вклада (пая) с обязательным начислением пени за просрочку (согласно ст. 452 ГК РФ, попытка претензионного урегулирования является обязательной перед подачей судебного иска). Далее следует обращение в суд с исковым заявлением.
Важно: максимальные шансы вернуть денежные средства и получить по ним проценты имеют клиенты КПК, обратившиеся в суд раньше остальных, так как при процедуре банкротства важно попасть в реестр кредиторов в числе первых (на всех средств не хватит).
Следовательно, чем раньше вы обратитесь за профессиональной юридической помощью, тем выше ваши шансы.
Чем поможет профессиональный юрист
Задачи, которые четко и со знанием выполнит опытный специалист, включают в себя:
- сбор пакета документов, подтверждающих факт вложения средств в конкретные кредитно-потребительские кооперативы;
- проведение переговоров в рамках попытки досудебного (мирного) урегулирования дела;
- в случае установленной невозможности мирного урегулирования — составление и передача искового заявления в суд;
- представление интересов клиента в судах разных инстанций;
- информационная поддержка, контроль над выполнением судебного решения.
Наши юристы и адвокаты имеют солидный опыт работы с обманутыми вкладчиками, им нередко удаётся решить проблему в досудебном порядке, они отлично знают основания для раннего запуска судебного разбирательства.
Помните: чем раньше вы обратитесь за помощь, тем результативнее она будет!
Мы готовы проконсультировать вас по всем вопросам и приступим к урегулированию конфликта сразу же после подписания договора.
КПК опубликовала важный документ о миссии и вкладе партии /подробная версия/_Russian.news.cn
Фото Синьхуа
Пекин, 26 августа /Синьхуа/ — Отдел пропаганды Центрального комитета Коммунистической партии Китая /ЦК КПК/ в четверг опубликовал важный документ о миссии и вкладе КПК.
В документе, озаглавленном «КПК: историческая миссия и вклад», подчеркивается, что за последние сто лет вся борьба, самопожертвования и творения КПК и китайского народа под руководством партии были направлены на достижение одной цели — осуществление великого возрождения китайской нации.
«Осуществление великого возрождения китайской нации — это историческая миссия КПК, а создание прекрасной жизни для народа — твердая цель борьбы партии», — отмечается в документе.
Согласно документу, КПК — это политическая партия, которая борется за народ и всегда ставит его интересы превыше всего. КПК придерживается законов общественного развития и уважает ведущую роль народа в создании истории.
КПК преследует благородную цель — работать на благо китайского народа и делать все в его интересах, говорится в документе.
Также подчеркивается, что марксизм является основополагающей руководящей идеей и духом КПК, а также ярким знаменем, под которым КПК непрерывно движется вперед.
Согласно документу, в целях достижения независимости, развития и процветания государства КПК должна иметь сильное и решительное руководство.
«Именно солидарность и единство КПК, ее твердое руководство и сильный управленческий потенциал сплотили и объединили сотни миллионов китайцев и помогли преодолеть множество трудностей и кризисов», — говорится в документе.
Кроме того, КПК всегда удавалось сохранять бодрость и жизнеспособность и оставаться в авангарде эпохи, несмотря на многочисленные трудности, с которыми она столкнулась за последнее столетие.
Это стало возможным благодаря тому, что КПК, ведя народ к великой социальной революции, смогла совершить великую самореволюцию. В целях сохранения здоровья и жизнеспособности своих рядов КПК всегда придерживается всестороннего устрожения внутрипартийного управления, продвигая самоочищение, самосовершенствование, самообновление и самоулучшение в соответствии с требованиями времени, говорится в документе.
КПК — это политическая партия, целью которой является не только счастье китайского народа, но и прогресс всего человечества. КПК всегда придерживается таких общечеловеческих ценностей, как мир, развитие, равенство, справедливость, демократия и свобода. Она неустанно продвигает дух интернационализма, всегда стоит на правильной стороне истории и на стороне человеческого прогресса, вносит свой вклад в обеспечение мира и развития во всем мире, отмечается в документе.
1 2 1 2Процентные ставки по сбережениям в КПК превышают банковские
Источник: Журнал «Полное Право» №27 от Консультант Плюс.
Героем рубрики стал Кредитный потребительский кооператив (КПК) «Сибирский капитал». Компания в течение 4 лет входит в многочисленное сообщество пользователей КонсультантПлюс. Уважаемые читатели, предлагаем вам поближе познакомиться с деятельностью Кооператива.
На вопросы редакции ответил
Вадим Головко, заместитель Управляющего по Тюменской области КПК «Сибирский капитал».
— Вадим, для чего нужна такая форма кредитных организаций – кооператив?
— Кредитные кооперативы занимают особое место в финансовой системе страны. Они созданы и функционируют по принципу взаимопомощи. Кооперативы по своей природе способствуют увеличению общего благосостояния, поскольку они принадлежат всем своим пайщикам. К тому же, кооперативы обеспечивают доступ к финансовым услугам там, где другие финансовые институты работают неэффективно из-за высоких удельных затрат на работу с мелкими вкладами и заемщиками.
— То есть у кредитных кооперативов хорошие перспективы развития?
— В настоящее время кредитное кооперативное движение в России активно развивается. Этому способствуют федеральное законодательство и нормативные акты, регулирующие деятельность кооперативов. Их работу контролируют Центральный банк и саморегулируемые организации кредитных кооперативов. Вступление в КПК становится все более популярным способом вложения средств и получения займов.
— Чем кооперативы так привлекательны для людей?
— Интерес к нашей системе сбережений возрастает, так как процентные ставки по сбережениям в КПК превышают банковские и существенно опережают темпы инфляции.
Чтобы отвечать потребностям людей, мы, в кооперативе «Сибирский Капитал», постоянно расширяем линейку заемно-сберегательных продуктов. С недавнего времени действует тариф по сбережениям «Летний», который позволяет еженедельно снимать проценты. В перспективе внедрение займа на приобретение жилья.
К тому же, мы планируем расширить спектр дополнительных услуг для пайщиков. Кроме возможности купить авиа и ж/д билеты, получить справку о размере займа или помощь в заполнении документов, пайщикам станут доступны денежные переводы, пластиковые карты, оплата ЖКХ и мобильной связи, услуги негосударственных пенсионных фондов и страховых компаний.
— Для чего объединять такие разные виды услуг в одном месте?
— Мы надеемся, что «Сибирский капитал» – организация, которая не просто выдает займы и принимает сбережения, а позволяет сделать жизнь наших пайщиков лучше.
— Какого главного правила вы придерживаетесь в работе?
— Что главное для кооператива? Главное – конечно же, люди, его пайщики. Внимание к каждому, доброжелательное отношение и готовность всегда помочь при оказании финансовых услуг – основа нашей работы.
— И последний вопрос: какую роль играет система КонсультантПлюс в рабочем процессе вашего кооператива?
— Сегодня КонсультантПлюс – один из лучших сборников нормативных актов и законов России со всеми последними обновлениями. Благодаря этой справочной системе отдел бухгалтерского учета, отдел кадров и юристы обеспечены всеми необходимыми документами нормативного характера, а также консультационными материалами. Материалы из судебной практики – отличное дополнение. Сложно переоценить вклад системы КонсультантПлюс в работу всего кооператива – она обеспечивает нормальные рабочие процессы организации.
— Вадим, благодарим Вас за внимание и желаем кооперативу развития и новых интересных проектов!
Справка о компании
Кредитный потребительский кооператив «Сибирский капитал» – некоммерческая организация, которая предоставляет своим пайщикам финансовую помощь, направленную на целевые потребительские нужды, а также предоставляет возможность приумножить денежные средства.
КПК «Сибирский капитал» существует с 2010 года, является членом Некоммерческого партнерства «Саморегулируемая организация кредитных потребительских кооперативов «Кооперативные Финансы».
За эти годы кооператив достаточно окреп и вырос. «Сибирский капитал» объединяет более 7000 пайщиков и имеет 23 дополнительных офиса в Тюменской и Омской областях.
Ростовчанам разъясняют вопросы деятельности кредитных потребительских кооперативов
Оформление кредита в банке иногда требует немало времени и сил. Гораздо проще и быстрее получить деньги в кредитном потребительском кооперативе (КПК).
В последнее время все больше возрастает интерес к такому виду денежного займа.
На наиболее частые вопросы о том, что такое кредитные кооперативы и как не ошибиться при их выборе рассказывает директор Департамента экономики города Светлана Камбулова.
Светлана Анатольевна, так что же из себя представляют кредитные кооперативы?
Кредитные потребительские кооперативы (КПК) — это подобие касс взаимопомощи. Люди или компании одного региона, профессии, рода деятельности, социального статуса объединяются, чтобы самим решать свои финансовые задачи. Они скидываются «в общий котел» (фонд финансовой взаимопомощи) и сами же могут одалживать часть этих общих денег под проценты.
В кооперативе можно получить заем как для бизнеса, но и для личных нужд. Процент обычно выше, чем в банках, зато получить его проще. И наоборот, можно вложить деньги в КПК и получить доход больше, чем по банковскому депозиту. Но такие вложения не попадут под защиту Агентства по страхованию вкладов. КПК также могут привлекать займы от сторонних компаний, даже если они не являются их пайщиками.
КПК — некоммерческая организация, то есть создается не для получения прибыли. КПК не занимаются ни торговлей, ни производством, ни каким-либо сервисом.
Какими преимуществами обладают члены кооперативов?
Члены кооператива сами решают, на каких условиях КПК будет работать: под какой процент будет привлекать средства, под какой процент и в каком размере выдавать займы, а также каким будет минимальный пай — доля, которую вносят в капитал его участники. Решение зависит от всех участников КПК.
Члены кооператива могут свободно выйти из КПК и забрать свой пай в любой момент.
Как не ошибиться при выборе кооператива?
Поскольку под КПК иногда маскируются финансовые пирамиды и обычные мошенники. Рекомендуется соблюдать несколько правил при выборе.
Юридическая форма организации должна быть «Кредитный потребительский кооператив» (КПК) или «Сельскохозяйственный кредитный потребительский кооператив» (СКПК). Все остальные формы — ООО, ОАО, ЗАО, ИП — не имеют к КПК и СКПК никакого отношения. Названия типа ООО «Кредитный потребительский кооператив» или ЗАО «Приобретательский кредитный кооператив» намеренно вводят граждан в заблуждение.
Гражданин может зайти на сайт Банка России и найти там свой кооператив, чтобы сверить данные государственного реестра с реквизитами КПК (полное название, ИНН, ОГРН).
Агрессивная реклама должна насторожить. Явным обманом являются лозунги типа «50% годовых по вкладам в КПК!», «Вклады в КПК застрахованы государством. Проценты в кооперативах действительно выше банковских, но не в несколько раз. Стандарты саморегулируемых организаций кооперативов ограничивают доходность вложений: максимум составляет 1,8 от действующей ключевой ставки, которую можно посмотреть на главной странице сайта Банка России. Например, на 1 марта 2018 года ключевая ставка составила 7,5% — и значит, КПК не могли предложить доходность выше 13,5% годовых.
Должны настораживать предложения денежных средств либо необоснованных бонусов за активное привлечение большего числа новых пайщиков-вкладчиков. Это характерно для финансовой пирамиды.
Кредитный потребительский кооператив — хорошая альтернатива банковским услугам, особенно для частных предпринимателей и малого бизнеса. Но членство в КПК требует осмотрительности и активного участия в работе кооператива.
@ Мурашкина Надежда Михайловна, МУП «Городская газета «Ростов официальный»
Тел. :(863) 240-83-08
Вклад OmpK36 в чувствительность к карбапенемам у KPC-продуцентов Klebsiella pneumoniae
Изоляты, принадлежащие к клональной группе A
Одиннадцать изолятов принадлежали к клональной группе A, штамм, ответственный за ~ 85% из bla KPC , содержащих изоляты в наших изолятах. регион (Брату и др. , 2005a). Пять изолятов не содержали bla KPC , но имели ESBL (либо bla SHV-12 -подобных, либо bla SHV-11 -подобных) и имели пониженную чувствительность к цефтазидиму (таблица 2).Расхождение в чувствительности к цефалоспорину для изолятов CI504 и CI505 не могло быть объяснено информацией, полученной от каждого изолята. У всех пяти была сниженная экспрессия ompK35 , и секвенирование ДНК выявило мутацию сдвига рамки считывания в этом гене. Все пять экспрессировали ompK36 и, в соответствии с другими сообщениями, оставались чувствительными к цефокситину и карбапенемам (Ardanuy et al. , 1998; Crowley et al. , 2002; Doménech-Sánchez et al. , 2000, 2003). ; Мартинес-Мартинес и др., 1996). Шесть изолятов в этой клональной группе обладали bla KPC-2 (вместе с другими β -лактамазами). Несмотря на вариабельную экспрессию ompK35 , все эти изоляты обладали одной и той же мутацией сдвига рамки считывания, и OmpK35 не был выявлен с помощью SDS-PAGE (фиг. 1) и MALDI MS. Секвенирование ДНК показало, что ген ompK36 в этой группе был тесно связан с геном, обнаруженным в опубликованном геноме изолята MGH 78578. Экспрессия ompK36 была вариабельной в этих шести изолятах и коррелировала с данными SDS-PAGE (рис.1). Изоляты с доказательством продукции OmpK36 имели более низкие значения MIC по отношению к имипенему при определении микроразбавлением в бульоне (таблица 2) и имели разбросанные колонии в зоне ингибирования Etest (фиг. 2a). Все шесть были устойчивы к меропенему и эртапенему (таблица 2). Экспрессия acrB не коррелировала с MIC карбапенемов (данные не показаны).
Анализ белков внешней мембраны изолятов K. pneumoniae с помощью SDS-PAGE. Клональная группа, название изолята и относительная экспрессия ompK36 с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени представлены для каждой дорожки.Меченые белки идентифицировали с помощью MALDI MS.
Imipenem Etest изображения изолятов с переменной экспрессией bla KPC и ompK36 . (а) Изоляты клональной группы А; (b) изоляты из клональной группы B. Относительная экспрессия каждого гена изолята приведена под его изображением.
Таблица 2.
Наличие других β -лактамаз, экспрессия с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени bla KPC , ompK35 и ompK36 и МИК для β -лактамов из клинических изолятов принадлежность к клональным группам A и B
| Изолят | β -лактамаза (ы) | Наличие bla KPC-2 | Относительное выражение: * | MIC (мг л −1 ) † | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| bla KPC | ompK35 | ompK36 | MERT | FOX | CAZ | FEP | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Клональный группа A | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CI504 | 54 | 4,58 | 0,19 | 0,032 | 0,064 | 0,5 | > 256 | 3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CI505 | SHV-11 | Нет | ,20,064 | 0,5 | 4 | 0,5 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CI518 | SHV-12 | № | 0,13 | 1,01 | 0,5 | 064 | 0,047 | 0,75 | > 256 | 2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| VM522 | SHV-12 | Нет | 0,18 | 0,88 | 0,5 | 0,5 | 2563 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MA549 | SHV-12 | № | 0,18 | 0,87 | 0,38 | 0,047 | 0,38 | 0,047 | 0,38 | 2 9011 9001ШВ-11; ТЕМ-1 | Есть | 1 | 2.74 | 4,19 | 12 (8) | 16 (32) | 24 (32) | 48 | 128 | 16 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DM834 | SHV-12; ТЕМ-1 | Есть | 1,25 | 0,54 | 2,94 | > 32 (8) | > 32 (> 32) | > 32 (> 32) | 256 | > 256 | 24 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ВМ9 | ШВ-11; ТЕМ-1 | Есть | 1,1 | 0.49 | 1,7 | 12 (16) | 24 (16) | 24 (> 32) | 48 | > 256 | 192 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MA31 | SHV-12 | Да 1 | 0,06 | 0,25 | > 32 (32) | 24 (32) | > 32 (> 32) | 64 | > 256 | 24 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CI507 | SHV-11; ТЕМ-1 | Есть | 3,75 | 0,17 | 0.06 | > 32 (512) | > 32 (> 32) | > 32 (> 32) | > 256 | > 256 | 192 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| KC850 | SHV-12; ТЕМ-1 | Да | 2,5 | 0,08 | 0,004 | > 32 (1024) | > 32 (> 32) | > 32 (> 32) | > 256 | > 256 | 128 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Клональная группа B | 12 SH516-CI ТЕМ-1 | № | 2.5 | 8,22 | 0,5 | 0,047 | 0,064 | 0,75 | > 256 | 24 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CI511 | SHV-12; ТЭМ-1 | № | 1,25 | 3,11 | 0,5 | 0,125 | 0,5 | 4 | > 256 | 16 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| KB164 | 16 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| KB164 | 9019 9019 1,45 | 3,03 | 0,12 | 0.125 | 0,38 | 3 | 128 | 6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CI806 | SHV-12; ТЭМ-1 | № | 1,11 | 1,81 | 0,25 | 0,125 | 0,75 | 4 | > 256 | 16 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CI513 90V-16 ТЭМ-1 | Да | 18,75 | 0,94 | 7,71 | 24 (8) | 6 (16) | 24 (32) | 128 | > 256 | 96 | Есть | 5 | 0.37 | 7,59 | > 32 (2) | > 32 (> 32) | > 32 (> 32) | 64 | > 256 | 48 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| WO822 | SHV-12; ТЕМ-1 | Да | 1,1 | 1,58 | 5,7 | 4 (8) | 24 (8) | > 32 (> 32) | 32 | > 256 | 256 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ШВ-12; ТЕМ-1 | Есть | 5 | 1.8 | 4,47 | > 32 (32) | > 32 (> 32) | > 32 (> 32) | > 256 | > 256 | 96 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| KB528 | SHV-11; ТЕМ-1 | Да | 22,5 | 0,16 | 3,28 | > 32 (256) | > 32 (> 32) | > 32 (> 32) | > 256 | > 256 | 256 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Изоляты, принадлежащие к клональной группе B
Девять изолятов принадлежали к клональной группе B, второму важному штамму bla KPC в нашем регионе (Bratu et al., 2005а). Четыре изолята, обладающих БЛРС (без bla KPC ), экспрессировали ompK36 и оставались чувствительными к цефокситину (и устойчивыми к цефтазидиму; таблица 2). Пять изолятов обладали bla KPC-2 . Хотя у большинства из них были доказательства транскрипции ompK35 с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени, продукция OmpK35 не была очевидна с помощью SDS-PAGE (фиг. 1), что указывает на пост-транскрипционные события, влияющие на этот порин. Все изоляты в этой группе имели достаточную экспрессию ompK36 , и это было также очевидно с помощью SDS-PAGE (рис.1). За исключением вставки из 2 аминокислот (Gly-Asp) в области петли 3 порина, OmpK36 для изолятов в этой группе был аналогичен таковому, обнаруженному в чувствительном контроле, K. pneumoniae ATCC 13883. По сравнению с OmpK36, обнаруженным в клональная группа А, белок в этой группе имел вставку из 7 аминокислотных остатков в области петли 6 порина (в дополнение к нескольким аминокислотным заменам). Несмотря на продукцию OmpK36 в этих пяти изолятах с bla KPC , следует отметить, что снижение экспрессии ompK36 все еще влияло на МИК микроразбавления бульона и зоны Etest ингибирования имипенема (таблица 2, рис.2б). По-видимому, несмотря на продукцию OmpK36 в этой группе, небольшие количественные или качественные изменения в порине повлияли на поступление β -лактамов. Также примечательно, что МИК меропенема, эртапенема и цефокситина в изолятах группы В без bla KPC были выше, чем у изолятов сопоставимой группы А. Следовательно, похоже, что фенотип OmpK36 в изолятах группы B влияет на поступление β -лактамов. Наконец, экспрессия acrB не коррелировала с устойчивостью к карбапенему для изолятов в этой группе (данные не показаны).
Оказалось, что существует взаимодействие между экспрессией bla KPC и ompK36 , которое влияет на MIC имипенема. По сравнению с изолятом WO822 изоляты CI513 и CI839, которые имели более высокую экспрессию bla KPC и ompK36 , имели значительно более высокие значения MIC имипенема (фиг. 2b). Исследования гидролиза карбапенема подтвердили результаты исследований экспрессии bla KPC . По сравнению с изолятами с уровнем экспрессии 1–1.В 25 раз превышающая контрольную экспрессию bla KPC , изоляты с ≥2,5-кратным уровнем экспрессии имели тенденцию к увеличению скорости спектрофотометрического гидролиза имипенема [0,22 ± 0,16 против 0,13 ± 0,07 мкг (мг белка) -1 мин. -1 ] и меропенема [0,12 ± 0,09 против 0,09 ± 0,04 мкг (мг белка) -1 мин -1 ] и значительно увеличили скорость гидролиза эртапенема [0,09 ± 0,06 против 0,05 ± 0,02 мкг (мг белок) −1 мин −1 , P = 0.05].
Экспрессия ompK35 и ompK36 также оценивалась в четырех неродственных клинических изолятах, чувствительных к цефалоспорину. По сравнению с контрольным штаммом, K. pneumoniae ATCC 13883, экспрессия ompK35 была аналогичной (в среднем в 1,9 раза больше контроля, диапазон 0,43–4,4) в этих чувствительных изолятах. Однако экспрессия ompK36 была увеличена по сравнению с контрольным изолятом (в среднем в 4,4 раза больше контроля, диапазон 2,0–5,4). Следовательно, хотя К.pneumoniae ATCC 13883 часто используется в качестве контроля в исследованиях белков внешней мембраны, экспрессия генов, кодирующих порины, в этом изоляте снижена по сравнению с клиническими изолятами дикого типа.
Особую тревогу вызывает быстрое и в некоторых регионах неослабевающее распространение K. pneumoniae с KPC β -лактамаз. Клинические лаборатории полагались на чувствительность к карбапенемам для выявления патогенов, содержащих эти ферменты; однако хорошо задокументировано, что многие изоляты с KPC β -лактамазами будут иметь МИК карбапенемов ниже контрольной точки чувствительности, определенной CLSI (Anderson et al., 2007; Bratu et al. , 2005b; Tenover et al. , 2006). В этом отчете с участием важных внутрибольничных штаммов K. pneumoniae , эндемичных для Нью-Йорка, было обнаружено, что МПК карбапенемов зависят от взаимодействия между присутствием bla KPC и экспрессией ompK36 . Также было очевидно, что фенотип OmpK36 может влиять на восприимчивость. Изоляты, которые обильно экспрессировали ompK36 , имели тенденцию иметь более низкие значения MIC имипенема при использовании метода микроразбавления в бульоне и имели разбросанные колонии в зоне ингибирования Etest.В соответствии с другими сообщениями, МПК эртапенема были постоянно выше, чем у имипенема и меропенема, для изолятов, обладающих bla KPC (Anderson et al. , 2007; Bratu et al. , 2005b). Изоляты, у которых МИК имипенема и меропенема находились в чувствительном или промежуточном диапазоне, по-прежнему оставались откровенно устойчивыми к эртапенему. Поскольку все исследованные нами изоляты имели либо сниженную, либо дефектную продукцию OmpK35 (типично для многих штаммов, обладающих БЛРС), вклад этого порина в устойчивость к эртапенему не может быть оценен в этом отчете.Однако предыдущие исследования не показали, что этот порин важен для развития устойчивости к карбапенему (Hernández-Allés et al. , 1999a). Другие исследования показали, что восстановление OmpK36 и OmpK37 улучшает чувствительность к эртапенему у KPC-продуцирующих изолятов K. pneumoniae (Jacoby et al. , 2004). Однако OmpK37 часто не экспрессируется (Doménech-Sánchez et al. , 1999), и его роль в устойчивости клинических изолятов к карбапенемам неизвестна.
Хотя цефамицины сохраняют активность против многих изолятов, продуцирующих БЛРС K. pneumoniae , они часто не рекомендуются в качестве терапевтических средств из-за развития резистентности (вторичной по отношению к снижению продукции OmpK36). Аналогичную осторожность следует проявлять в отношении изолятов, продуцирующих KPC, которые кажутся чувствительными к имипенему или меропенему, поскольку подавление экспрессии ompK36 будет отрицательно влиять на MIC для карбапенемов.
Границы | Множественные клоны Klebsiella pneumoniae KPC способствуют длительной госпитальной вспышке
Введение
Klebsiella pneumoniae ( Kp ) встречается повсеместно в окружающей среде, является частью нормальной кишечной микробиоты человека и способна колонизировать кожу и носоглотку здоровых людей (Podschun and Ullmann, 1998; Broberg et al., 2014). Kp может сохраняться на абиотических поверхностях различного происхождения за счет синтеза биопленки, которая также может сделать бактерии устойчивыми к действию антимикробных агентов (Di Martino et al., 2003). У госпитализированных пациентов с ослабленным иммунитетом или ослабленных пациентов с тяжелыми основными заболеваниями Kp вызывает инфекции мочевыводящих путей, дыхательных путей и кровотока (Podschun and Ullmann, 1998), а также другие менее частые заболевания, включая остеомиелит, артрит (Ghorashi et al., 2011) и менингит (Ko et al., 2002; Tumbarello et al., 2006; Nordmann et al., 2009). Kp отвечает примерно за 12% грамотрицательных инфекций в больничных отделениях интенсивной терапии (ОИТ) в Европе (Европейский центр профилактики и контроля заболеваний [ECDC], 2016). Kp инвазивные инфекции связаны с высокими показателями заболеваемости и смертности из-за высокой распространенности устойчивости к большинству доступных противомикробных средств (Patel et al., 2008; Borer et al., 2009). Это возникающая проблема в клинической медицине, приводящая к увеличению показателей смертности и затрат.
Наиболее часто используемым классом антибиотиков против нозокомиальных инфекций является β-лактамы, который включает производные пенициллина, цефалоспорины, монобактамы и самые недавно разработанные карбапенемы. Частое употребление и злоупотребление этими препаратами в сочетании с трансмиссивностью детерминант устойчивости, опосредованной мобильными элементами (плазмидами, транспозонами и другими интегративными конъюгативными элементами), способствовало распространению устойчивости к β-лактамам Kp (Mathers et al. ., 2015; Навон-Венеция и др., 2017). За последние 20 лет появление изолятов, устойчивых к карбапенемам, ограничило эффективность этого варианта лечения последней линии, препятствуя использованию всего этого класса антибиотиков, с несколькими альтернативами (Mathers et al., 2015; Navon-Venezia et al. , 2017). Одним из наиболее распространенных механизмов устойчивости к карбапенемам у Kp является карбапенемаза K. pneumoniae (KPC). Это сериновый фермент молекулярного класса А Амблера, способный гидролизовать широкий спектр β-лактамов.Карбапенемазы KPC кодируются плазмидой, они были первоначально связаны с клональной группой 258 Kp (CG258) (Samuelsen et al., 2009; Breurec et al., 2013), но не ограничиваются этим, поскольку в ряде случаев о штаммах других типов последовательностей (ST), несущих этот ген, сообщалось (Giakkoupi et al., 2010; Qi et al., 2010; Tzouvelekis et al., 2013; Markovska et al., 2015; Oteo et al., 2016). ; Villa et al., 2016; Wei et al., 2016; Aires et al., 2017). KPC-несущие штаммы Kp недавно распространились по всему миру, причем некоторые страны, включая Италию, сильно пострадали.В Италии в 2017 г. 33,9% нозокомиальных инфекций Kp были вызваны штаммами KPC (Sabbatucci et al., 2017). Большинство этих штаммов принадлежат к CG258, который, как было показано в Италии, был импортирован четыре раза, что дало начало четырем итальянским субкладам (Gaiarsa et al., 2015). Распространение устойчивых к карбапенемам штаммов привело к возрождению использования колистина, от которого ранее отказались из-за его нефротоксичности и нейротоксичности (Javan et al., 2015; Velkov et al., 2018).Однако это привело к появлению устойчивых к колистину штаммов как из-за всплеска хромосомных мутаций (Cannatelli et al., 2014; Olaitan et al., 2014), так и к приобретению кодируемых плазмидой генов устойчивости (Di Pilato et al. др., 2016; Liu et al., 2016).
Полногеномное секвенирование (WGS) бактериальных изолятов все чаще используется для эпидемиологических исследований (Sabat et al., 2013). Использование геномики в клинических условиях в качестве рутинного инструмента может в будущем стать важным подспорьем для микробиологов в точном выявлении и характеристике вспышек на ранних стадиях, а также в определении путей передачи.Однако только сочетание данных типирования с клиническими и демографическими данными может быть получено для правильной интерпретации происхождения и развития вспышки (Van Belkum et al., 2007).
В настоящем ретроспективном исследовании анализируется внутрибольничная вспышка продолжительностью 10 месяцев (август 2015 г. — май 2016 г.), вызванная K. pneumoniae KPC, в отделении интенсивной терапии, а также период непосредственно до и после, в общей сложности 12 месяцев. Благодаря сочетанию геномных, микробиологических и клинических данных стало возможным реконструировать эпидемическое событие и охарактеризовать множество не связанных между собой штаммов, которые распространялись в основном в периоды, не перекрывающиеся во времени.
Событие
В Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo в Павии, больнице на 900 коек в Северной Италии, кардиореспираторные пациенты госпитализированы в специализированное кардиореспираторное отделение интенсивной терапии, где проводится предоперационная оценка, анестезиологическое лечение и интенсивное послеоперационное лечение пациентов, перенесших сердечную и грудную клетки. операции выполняются. Это отделение интенсивной терапии имеет восемь коек и обслуживается 37 сотрудниками. Все пациенты интенсивной терапии подвергаются наблюдению с помощью ректального мазка при поступлении и один раз в неделю во время пребывания в палате для мониторинга колонизации устойчивых к карбапенемам Enterobacteriaceae .В случае положительного результата применяются дополнительные контактные меры предосторожности, которые прерываются только после трех последовательных отрицательных контрольных проб и возобновляются в случае одного нового положительного скринингового мазка.
Ретроспективно увеличение числа колонизаций и инфекций устойчивых к карбапенемам Klebsiella pneumoniae (CRKP) в отделениях интенсивной терапии наблюдалось в период с августа 2015 года по май 2016 года. Первое заражение было зарегистрировано 15 августа 2015 года. число инфицированных и колонизированных пациентов постепенно увеличивалось и достигло пика дважды — в декабре 2015 и марте 2016 года.Когда было обнаружено первое увеличение случаев заболевания (декабрь 2015 г.), были предприняты дополнительные меры эпиднадзора: усиление обучения медицинского персонала и использование одноразовых устройств, более точная ежедневная очистка и усиление пассивного наблюдения. Экологические обследования были проведены в отделении после второго пика случаев в марте 2016 г., все результаты оказались отрицательными. Когортирование или пространственная изоляция отдельных пациентов не применялись. В июне 2016 года ситуация вернулась к норме, клинических инфекций не было (рисунок 1).Таким образом, был проанализирован период с июня 2015 г. по май 2016 г., чтобы понять характеристики наблюдаемой продолжительной вспышки. В течение этого периода в отделении интенсивной терапии было госпитализировано в общей сложности 426 пациентов, и процедура скрининга ректальных мазков на Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae выявила 23/426 пациентов с колонией CRKP (средний возраст: 61,1 года; диапазон: 27–80 лет). Из этих 23 пациентов 18 были отрицательными при поступлении в отделение интенсивной терапии. Двое из пяти пациентов (номера 6 и 22), у которых были положительные результаты при поступлении в отделение интенсивной терапии, ранее были госпитализированы в другие отделения (соответственно другое отделение интенсивной терапии и кардиохирургическое отделение), где они стали колонизированными.Остальные три пациента (номера 2, 4 и 7) дали положительный результат при первом мазке, что свидетельствует о положительном результате до госпитализации. Во время мероприятия 11/23 (47,8%) пациентов умерли, 2/23 (8,7%) были выписаны на реабилитацию и 10/23 (43,5%) были переведены в другие стационары или палаты. У одиннадцати из этих 23 (47,8%) пациентов развились явные инфекции, при этом CRKP был выделен из крови, дыхательных путей, мочи и ран. Семь из 11 инфицированных пациентов умерли в отделении интенсивной терапии.Демографические характеристики и характеристики госпитализации 23 пациентов представлены в Таблице 1. За тот же период в общей сложности восемь других пациентов оказались инфицированными некарбапенеморезистентным Kp , таким образом, 58% от общего числа Kp инфекций были CRKP.
Рис. 1. Количество положительных образцов на устойчивость к карбапенемам Klebsiella pneumoniae от пациентов, госпитализированных в отделение интенсивной терапии в период с августа 2015 года по май 2016 года. Образцы, положительные для скрининга ректальных мазков, окрашены в синий цвет; образцы, показывающие положительную инфекцию, окрашены в оранжевый цвет.
Таблица 1. Таблица, показывающая характеристики госпитализации всех пациентов, поступивших в ОИТ в исследуемый период, которые дали положительный результат на карбапенем-резистентный Klebsiella pneumoniae хотя бы один раз.
Материалы и методы
Заявление об этике
Исследование было разработано и проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрено этическим комитетом Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo в Павии, Италия.
Идентификация бактериального штамма и тестирование на чувствительность
В течение всего мероприятия все ректальные мазки для наблюдения были отправлены в Отделение микробиологии и вирусологии и помещены непосредственно в агар с хромидом CARBA (BioMérieux, Марси-л’Этуаль, Франция) для проверки на наличие продуцирующих карбапенемазу Enterobacteriaceae . В тот же период все клинические образцы (образцы крови, бронхиальный аспират, бронхоальвеолярный смыв, образцы мочи и мазки из ран) культивировали параллельно на всех следующих средах: Колумбийский кровяной агар с 5% овечьей крови, шоколадный агар, селективные среды. или на агаре Шедлера и 5% овечьей крови (BioMérieux SA, Марси-л’Этуаль, Франция) анаэробно и инкубировали при 37 ° C в течение ночи.Колонии, предположительно относящиеся к Kp на основании морфологии, были идентифицированы с помощью системы MALDI Biotyper 3.1, основанной на времени пролета с использованием матричной лазерной десорбционной ионизации (MALDI-TOF) (Bruker Daltonics, Бремен, Германия).
Мы выбрали подмножество изолятов Kp из контрольных и клинических образцов на основе типа образца, даты сбора и профиля устойчивости, чтобы выполнить дополнительную характеристику. Тестирование чувствительности к антибиотикам и определение минимальных ингибирующих концентраций (МПК) выполняли с использованием автоматизированной системы BD Phoenix 100 (Becton, Dickinson and Company, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США) и интерпретировали в соответствии с клиническими контрольными точками версии 6.0 Европейского комитета по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам [EUCAST] (2016). МИК для тигециклина и карбапенемов подтверждена тест-полосками E (BioMérieux, Marcy-l’Etoile, Франция). В соответствии с рекомендациями Европейского комитета по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам [EUCAST] (2016) и Европейского центра профилактики и контроля заболеваний [ECDC] (2016), МИК колистина были подтверждены с помощью микродилюции бульона (MIC-Strip Colistin (MERLIN Diagnostika GmbH, Германия) ).
Экстракция ДНК и секвенирование генома
Экстракцию общей ДНКпроводили для выбранных изолятов с использованием мини-набора QIAamp DNA (Qiagen, Италия) в соответствии с инструкциями производителя.ДНК секвенировали с использованием платформы Illumina MiSeq (Illumina Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) с последовательностями парных концов 2 × 250 п.н. после приготовления библиотеки Nextera XT.
Геномные анализы
Считывание последовательностибыло проверено на качество с помощью FastQC и обрезано с помощью программного обеспечения Trimmomatic (Bolger et al., 2014). Затем SPAdes-3.10.1 (Bankevich et al., 2012) использовался для сборки считываний на конце пары с использованием точных настроек. Профили мультилокусного типирования последовательностей (MLST) и варианты гена вирулентности / устойчивости были определены in silico с использованием инструмента Kleborate.Наличие гена mcr проверяли с помощью ResFinder версии 3.1.0 (база данных обновлена до 20 февраля 2019 г.) (Zankari et al., 2012). Содержание плазмид было охарактеризовано с помощью PlasmidFinder версии 2.0.1 (база данных обновлена до 20 ноября 2018 г.) (Carattoli et al., 2014), в то время как контиги, содержащие ген bla KPC, сравнивались с использованием программ BLASTn и Mauve (Darling et al., 2014). al., 2010) и подверглись филогенезу максимального правдоподобия с использованием RAxML (Stamatakis, 2014) с моделью замещения GAMMA с учетом систематической ошибки определения и применения поправки Льюиса (Lewis, 2001).Надежность топологии дерева проверялась с использованием 100 реплик начальной загрузки.
Для оценки геномной изменчивости полученные последовательности генома были добавлены к отобранному набору данных из геномов K. pneumoniae , извлеченных из базы данных PATRIC (Wattam et al., 2016). Геномы PATRIC были отобраны с использованием собственного скрипта так, чтобы они были наиболее близкими по геномному расстоянию к нашим штаммам. Подробно каждый геном сравнивался со всеми геномами базы данных PATRIC с помощью Mash (Ondov et al., 2016), и были отобраны 50 лучших совпадений.Все полученные списки лучших совпадений были объединены, удалив дублирование, чтобы получить окончательный набор геномных данных. CoreSNP были извлечены из результирующего набора данных в соответствии с опубликованным методом (Gaiarsa et al., 2015). Вкратце, программное обеспечение Mauve (Darling et al., 2010) использовалось для выравнивания всех новых геномов и подобных геномов PATRIC с хорошо охарактеризованным полным эталоном генома [NZ_CP006923 (DeLeo et al., 2014)]. Индивидуальные выравнивания были объединены с использованием скрипта Python для получения файла множественного выравнивания, позволяющего извлекать coreSNP (определяемые как варианты одного нуклеотида, фланкированные с каждой стороны двумя нуклеотидами, консервативными во всех проанализированных геномах).
Распределение расстояний coreSNP между штаммами было визуализировано с помощью программного обеспечения R версии 3.2.3 (R Core Team, 2013), а порог отсечения coreSNP был определен вручную, просмотрев график и обнаружив, что существует две группы генома. пары, имеющие менее 15 SNP и имеющие более 35 SNP (рис. 2). Распределение позволило нам с уверенностью сделать вывод, что два генома можно рассматривать как часть одного передающего кластера, если их расстояние в количестве coreSNP было ниже порогового значения 15 SNP.Выравнивание coreSNPs использовали для выполнения филогенетического анализа с использованием программного обеспечения RAxML (Stamatakis, 2014) с моделью замещения GAMMA, учитывая систематическую ошибку определения и применяя поправку Льюиса (Lewis, 2001). Надежность топологии дерева проверялась с использованием 100 реплик начальной загрузки.
Рисунок 2. Распределение CoreSNP между парами геномов. Пары геномов на расстоянии 16 SNP (порог SNP) рассматривались как часть одного кластера передачи.
Геномы эпидемических кластеров были исследованы также с целью выявления возможных уникальных геномных характеристик. Филогения на основе SNP была сгенерирована для каждого кластера, используя тот же подход, что и глобальная филогения, и добавляя к каждому кластеру геном, не являющийся частью кластера, который привел к наиболее близкому результату в глобальной филогении. Филогении и геномные выравнивания каждого кластера и их внешней группы были использованы в качестве входных данных для анализа рекомбинации с помощью программного обеспечения ClonalFrameML (Didelot and Wilson, 2015).Кроме того, наличие и количество вставных последовательностей (IS) было протестировано с использованием программного обеспечения ISSeeker (Adams et al., 2016) против всех IS, полученных из базы данных Issaga (Varani et al., 2011), с использованием « Klebsiella » в качестве организма. ключевое слово (дата 17 июля 2019 г.).
Результаты
Вспышка CRKP произошла в кардиореспираторном отделении интенсивной терапии с августа 2015 г. по май 2016 г. с участием 23 пациентов (12 колонизированных, 11 инфицированных). Чтобы охарактеризовать событие, мы извлекли все штаммы CRKP, выделенные во время события и за 2 месяца до него.Мы получили в общей сложности 144 образца, 98/144 (68,1%) образцов наблюдения и 46/144 (31,9%) клинических образцов (16 посевов крови, 12 бронхиальных аспиратов, 1 бронхоальвеолярный смыв, 8 мочи и 9 мазков из ран). В общей сложности 32/144 изолята K. pneumoniae из 22 ректальных мазков и 10 клинических образцов были отобраны на основе типов образцов и даты сбора, в том числе по крайней мере по одному на каждого из 23 положительных пациентов, для характеристики устойчивости к антибиотикам и генома. секвенирование (таблица 2).Результаты тестов на чувствительность к антибиотикам представлены в дополнительной таблице S1 и показывают, что все изоляты устойчивы по крайней мере к одному карбапенему: 32/32 к эртапенему, 31/32 к меропенему, 29/32 к имипенему. Более того, 31 изолят устойчив к аминогликозидам (25 — к амикацину, 22 — к гентамицину, 28 — к тобрамицину). Двадцать изолятов устойчивы к фосфомицину (МПК> 64 мг / л), 20 изолятов — к колистину (МПК от 4 до> 64 мг / л) и три — к тигециклину (МПК> 2 мг / л).Только один штамм из контрольного образца (ID генома: 1880) оказался устойчивым ко всем пяти классам антибиотиков.
Таблица 2. Описание 32 изолятов Klebsiella pneumoniae KPC, выбранных для геномной характеристики.
Полногеномные последовательности были получены для 32 отобранных штаммов с использованием технологии Illumina и собраны в черновые геномы после полировки считывания. В результате были получены геномы хорошего качества (средний N50: 1
; среднее число для контигов более 500 п.н. = 116; средний размер генома (5671622 п.н., полные характеристики генома см. В дополнительной таблице S2).Геномы представлены в EMBL и доступны под номером PRJEB32609 (ERP115310). Геномы были охарактеризованы путем расчета MLST, определения детерминант устойчивости к антибиотикам и факторов вирулентности (полные результаты см. В дополнительных таблицах S3, S4). Наиболее распространенным ST был ST258 ( n = 19, 59,4%), за ним следовал ST512 ( n = 11, 34,4%). Установлено, что один изолят принадлежит к ST45 (3,1%). Был обнаружен один новый ST, вариант с одним локусом (-SLV) ST940 (геном 1998 г. от пациента 5, теперь зарегистрированный как ST3985).Среди 5 пациентов, секвенировавших более одного изолята, один оказался колонизированным изолятами различных ST (пациенты 5).
Результаты анализа факторов устойчивости к антибиотикам (дополнительная таблица S3) были сгруппированы по 12 классам лекарств в соответствии с базой данных ARG-ANNOT (Gupta et al., 2014), причем β-лактамазы были разделены на шесть классов Лахи (Bush and Jacoby, 2010). Все 32 проанализированных изолята несли по крайней мере один ген ESBL (3,1% CTX-M-15, 3,1% SHV-1, 87,5% SHV-11, 6,3% SHV-12) и / или гены резистентных к ингибиторам β-лактамаз (87.5% ТЕМ-54 и 3,1% ТЕМ-122). Подтверждена устойчивость всех изолятов к карбапенемам (9,4% KPC-2 и 90,6% KPC-3). Клеборат идентифицировал устойчивость к колистину как усечение или потерю гена mgrB в 20 изолятах (62,5%), если менее 90% эталонного гена было покрыто считыванием секвенирования. Ручной анализ позволил обнаружить присутствие Последовательности вставки (IS5-подобной), прерывающей mgrB в двух устойчивых изолятах (1880 и 1753). Ранее сообщалось о сбоях из-за этого мобильного элемента (Cannatelli et al., 2014). Все другие устойчивые изоляты, принадлежащие к кластеру 3, демонстрировали мутацию сдвига рамки считывания в mgrB из-за вставки 10 нуклеотидов в положение 109 гена. Присутствие mcr генов исследовали с помощью ResFinder, но они так и не были обнаружены. Антибиотикограмма колистина и данные генома оказались согласованными для всех клонов, за двумя исключениями: клон 1760 был обозначен как устойчивый в Kleborate , но в результате оказался чувствительным при тесте на микроразведение, а клон 1870 был устойчив к фенотипическому тесту, но не к геномному анализу.
Результаты определения детерминант вирулентности показывают, что только 4/32 штамма (12,5%) содержат локус ybt , который кодирует путь биосинтеза сидерофоров иерсиниабактина (Lam et al., 2018). Не было обнаружено, что ни один из штаммов содержит другие сидерофоры (аэробактин и сальмохелин были проверены). Все четыре положительных штамма ybt были выделены из ректальных мазков различных пациентов и были единичными случаями. Два из них (геномы 1758 и 1760) показали ybt аллель 13, переносимый интегративным конъюгативным элементом: ICEKp 2.Два других изолята (геномы 1826 и 1998) показали соответственно варианты: ybt 10 (переносимый ICEKp 4) и ybt 4 (аллель, переносимый плазмидой). Связь между обнаруженными мобильными генетическими элементами и аллельными вариантами гена ybt согласуется с предыдущими наблюдениями (Lam et al., 2018). Биосинтетический путь выработки токсина колибактина, а также фактора вирулентности rmp A / rmp A2 (ответственного за экспрессию гипермукозно-вязкого фенотипа) отсутствовали у всех 32 штаммов.Наконец, с помощью инструмента Kleborate мы идентифицировали три различных K-локуса. Наиболее распространенным K-локусом был KL107 ( n = 28, 90,3%), за ним следовали KL106 ( n = 2, 6,5%) и KL24 ( n = 1, 3,2%). Как и ожидалось из литературы (Shu et al., 2009), было обнаружено, что они связаны с wzi аллелями 154, 29 и 101 соответственно. К-локус не был типируемым для одного изолята (1998 г.) (полные результаты см. В дополнительной таблице S4).
Распределение расстояний coreSNP среди 32 секвенированных геномов было рассчитано и нанесено на график для определения порогового значения, указывающего на эпидемиологическое родство.Четкий порог был обнаружен на 16 coreSNP (рис. 2), что позволило определить наличие трех клад геномов. Внутри каждой клады все геномы имеют взаимные расстояния coreSNP ниже рассчитанного порога. Была проведена глобальная филогения максимального правдоподобия coreSNP, включая 32 генома, исследованные в этой работе, и 172 родственных генома, извлеченных из базы данных PATRIC, чтобы контекстуализировать наши штаммы в окружающем разнообразии Kp . Геномы с расстояниями coreSNP ниже порогового значения сгруппированы в три монофилетических клады (рис. 3 для кладограммы, см. Также дополнительный рисунок S1, на котором показаны поддеревья трех кластеров) и, таким образом, считались частью трех отдельных кластеров вспышек (зеленого, красного и фиолетового цветов). кластеры на рисунках 3, 4).Пять из шести других геномов не объединяются с другими геномами вспышки и поэтому считаются спорадическими случаями. Последний оставшийся геном (2205) является филогенетической сестринской группой кластера 2, но представляет относительно большое количество coreSNP с другими геномами кластера (в среднем 42 coreSNP) и, таким образом, рассматривался как отдельный, спорадический случай.
Рисунок 3. Филогенетическое дерево, основанное на coreSNPs из 32 Klebsiella pneumoniae, штаммов KPC, выделенных из отделения интенсивной терапии, и 172 родственных генома, полученных из базы данных PATRIC.Спорадические штаммы выделены синим цветом; зеленым, красным и фиолетовым цветом обозначены геномы, принадлежащие трем монофилетическим кластерам (расстояние в SNP <16).
Рисунок 4. Хронология присутствия устойчивых к карбапенемам Klebsiella pneumoniae положительных пациентов в отделении интенсивной терапии в период с июня 2015 г. по май 2016 г. Сроки госпитализации выделены серым цветом. Другие цвета обозначают секвенированные образцы на основе геномной характеристики. Зеленый, красный и фиолетовый цвета соответствуют трем кластерам, идентифицированным на основе расстояния SNP, спорадические случаи отмечены синим цветом.Образцы, полученные при клинических инфекциях (не мазки для наблюдения), обозначены звездочками. Крестики указывают на смерть пациента. Черные кружки указывают на первый положительный ректальный мазок на CRKP для каждого пациента, отрицательный при поступлении. Черные треугольники указывают на первый положительный ректальный мазок на CRKP у пациентов, уже колонизированных CRKP на момент поступления в больницу. Черными ромбами обозначены пациенты, у которых в других палатах был положительный результат.
Сравнительный геномный анализ был проведен в пределах трех клад и для сравнения их с их ближайшим соседом, показав очень ограниченные геномные вариации.Никакой рекомбинации не было обнаружено в происхождении какой-либо из трех эпидемических клад (дополнительный рисунок S2). Содержание IS изолятов каждого из трех очаговых кластеров сравнивали с помощью ISfinder. В результате содержание IS было стабильным в каждом кластере, в то время как в каждом кластере оказалось больше IS, чем у эволюционно ближайших спорадических изолятов. В частности, изоляты кластера 1 имеют IS семейств ISL3 и IS1, которые отсутствуют в спорадической сестринской группе. Изоляты кластера 2 представляют собой последовательности IS66, отсутствующие в эволюционно ближайшем спорадическом изоляте.Изоляты кластера 2 также богаче последовательностями ISL3 и IS6, чем их сосед, а изоляты кластера 3 богаче последовательностями IS5 и IS6. Однако следует отметить, что точность, особенно количественная, такого анализа черновых геномов ограничена из-за трудностей в сборке последовательностей IS (дополнительный рисунок S3).
Обсуждение
Здесь мы представляем результаты комплексной характеристики штаммов CRKP, выделенных в течение 1-летнего периода (10 месяцев вспышки плюс 2 месяца до этого) в кардиореспираторном отделении интенсивной терапии больницы Сан-Маттео в Павии, Северная Италия.Ретроспективно, начиная с августа 2015 года, мы наблюдали сильное увеличение CRKP, выделенного из ректальных мазков, взятых у каждого пациента интенсивной терапии каждую неделю, что указывает на большое количество колонизированных пациентов. Мы также наблюдали увеличение выделения CRKP из клинических образцов, что указывает на явные инфекции. Эта тенденция продолжалась до июня 2016 года, когда в общей сложности было 23 колонизированных пациента, из которых 11 инфицированы, что послужило поводом для исследования, представленного здесь. Характеристика устойчивости к антибиотикам в сочетании с секвенированием генома 32 изолятов от этих 23 пациентов (таблица 2), собранных в период вспышки и за 2 месяца до нее, позволила охарактеризовать длительную вспышку.Было обнаружено, что большинство штаммов принадлежит к CG258, одной из самых распространенных групп, несущих KPC, в Италии и во всем мире (Gaiarsa et al., 2015; Onori et al., 2015).
Выполняя дистанционный анализ SNP (рис.1), мы обнаружили, что двадцать шесть из 32 изолятов в результате принадлежали к трем кластерам генома (coreSNPs <16), которые появились в отделении интенсивной терапии, заразили нескольких пациентов, а затем исчезли с одним единственным штаммом. длится большую часть события (рисунок 4, см. также дополнительный рисунок S1 для филогенетических реконструкций трех кластеров).Остальные шесть геномов оказались неродственными и, следовательно, были классифицированы как спорадические изоляты, поскольку все они показали более 35 coreSNP со всеми другими проанализированными геномами. Этот результат согласуется с недавним многоцентровым исследованием, в котором предлагалось установить порог для расстояния SNP в вспышке Kp на 21 год (David et al., 2019). Интересно, что четыре из шести спорадических изолятов представляют собой штаммы, охарактеризованные за 2 месяца до вспышки (июнь – август 2015 г., см. Рис. 4), что указывает на то, что в отделении интенсивной терапии присутствовало несколько штаммов, но они были ответственны только за колонизацию, а не вызывают клинические инфекции и не распространяются на нескольких пациентов.Шесть спорадических изолятов характеризуются различными уровнями устойчивости к антибиотикам (количество классов устойчивости, определенных с помощью клебората, варьируется от 3 до 11). Два из них устойчивы к колистину (ID генома: 1753, 1760). Что касается вирулентности, единственными изолятами, которые представляют иерсиниабактин, являются четыре из шести спорадических изолятов, все изолированные от колонизированных, но не инфицированных пациентов. Большинство спорадических изолятов принадлежат к CG258 ( n = 4), один принадлежит к ST45, о котором уже сообщалось как о штамме, несущем KPC в Италии (Cristina et al., 2016), и последний к новому ST, варианту ST940, теперь классифицируемому как ST3985. Эти спорадические изоляты могут иметь эпидемиологическое значение, действуя как «резервуар» для распространения мобильного элемента, несущего bla KPC.
Штамм, ответственный за первый кластер изоляций, относящийся к ST512, был выделен от пациента 5 из скринингового образца в августе 2015 года, а затем из клинических образцов в сентябре. Пациент оставался колонизированным до своей смерти в марте.Изоляты этого кластера характеризуются устойчивостью к 10 классам антибиотиков, оставаясь чувствительными к колистину, за двумя исключениями. Первый (ID генома: 1880) — единственный штамм кластера, принадлежащий пациенту 6, который демонстрирует соответствие между фенотипическим (MIC> 64 мг / л) и генотипическим (потеря / усечение гена mgr B) колистином. сопротивление. Другой штамм кластера, устойчивый к колистину (ID генома: 1870), был третьим из четырех во временной серии, выделенной от пациента 5, и показал фенотипически устойчивый к колистину (MIC = 4 мг / л), хотя мутации устойчивости к колистину не было. / ген был обнаружен в геноме.Чтобы исследовать наличие других мутаций, потенциально вызывающих устойчивость к колистину, геномы изолятов, принадлежащих пациенту 5, были исследованы вручную, обнаружив 2 SNP, уникальные для изолята, устойчивого к колистину. Эти SNP совместно локализованы в межгенной области перед опероном pca , потенциально ответственным за путь β-кетоадипата. Чтобы понять, могут ли эти SNP быть связаны с устойчивостью к колистину, потребуются дополнительные исследования.
1 декабря у пациента 5 был выделен еще один CRKP.Этот изолят не был родственником изолятов кластера 1, принадлежащего ST3985 (новый SLV ST940). Чтобы оценить, приобрел ли этот штамм плазмиду KPC из штамма ST512, одновременно присутствующего у пациента 5, мы сравнили контиги, несущие ген KPC, выполнив филогенетический анализ, включая контиги из изолятов кластера 1, из ST3985 и из другого спорадический изолят (1753) в качестве контроля. Мы обнаружили, что контиг, несущий KPC из ST3985, отличался от всех идентичных контигов, полученных из изолятов ST512, принадлежащих к кластеру 1, но также и от спорадического контроля, что привело к сестринской группе изолятов кластера (дополнительный рисунок S4).
Четыре изолята были сгруппированы в кластер 2, снова принадлежащий к ST512. Этот клон был недолговечным, но был передан от пациента 7 трем другим пациентам в течение 6 недель и вызвал одну клиническую инфекцию. Изоляты этого кластера устойчивы к большинству антибиотиков, сохраняя чувствительность к колистину и тигециклину. Два из четырех изолятов оказались фенотипически чувствительными к аминогликозидам, тогда как результаты анализа генома согласуются только частично, указывая на то, что все четыре штамма несут ген aph4-Ia , который должен придавать устойчивость к этому классу антибиотиков.
Самый крупный из кластеров представлен 17 штаммами, выделенными от 12 пациентов в течение 5 месяцев, вызвав пять клинических инфекций и приведших к трем смертельным исходам. Изоляты этого кластера характеризуются наивысшим уровнем устойчивости, сохраняя чувствительность только к тигециклину. Геномный анализ согласуется с этим результатом, указывая на присутствие генов устойчивости к 11 классам антибиотиков, на один больше, чем к двум другим кластерам. Действительно, все изоляты этого кластера оказались устойчивыми к колистину с помощью фенотипических тестов, и анализ содержания генома с использованием клебората выявил возможное вызывающее устойчивость усечение в гене mgrB во всех 17 штаммах.Ручной анализ позволил выявить мутацию сдвига рамки считывания в mgrB из-за вставки десяти нуклеотидов в положение 109 гена.
Заключение
В течение 1 года девять различных штаммов устойчивого к карбапенему K. pneumoniae были выделены в отделении интенсивной терапии от 23 пациентов, 12 только колонизированы, 11 инфицированы. Три штамма колонизировали несколько пациентов, были причиной всех семи клинических инфекций, зарегистрированных в отделении интенсивной терапии в этот период, и были ответственны за вспышку, которая длилась 10 месяцев.Три вспышечных штамма не показали большего количества генов вирулентности, чем шесть спорадических изолятов, четыре из которых были фактически единственными, у которых обнаружен иерсиниабактин. Что касается устойчивости к антибиотикам, как вспышки, так и спорадические штаммы были фенотипически устойчивы к большинству классов, что подтверждается сильным репертуаром генов устойчивости. Таким образом, четкая корреляция между профилями устойчивости к антибиотикам и количеством колонизаций или инфекций не очевидна. Наши результаты подчеркивают важность общего экологического контекста, возможно, больше, чем внутренних характеристик штамма, в определении распространения различных изолятов CRKP.
Заявление о доступности данныхГеномы, созданные для этого исследования, можно найти в репозитории EMBL EBI под записью PRJEB32609.
Заявление об этике
Ни одобрения комитета по этике, ни информированного согласия не требовалось, так как все собранные данные были полностью анонимными, не было никаких контактов с пациентами и / или их семьями, и не было сделано никаких вмешательств или изменений в лечении и управлении в соответствии с институциональными руководящими принципами.
Взносы авторов
CF, CB, PM и DS разработали проект.МС и ПК провели микробиологические анализы. ES выполнила секвенирование генома. CF, SG и FC провели биоинформатический анализ. CF, MC и DS провели эпидемиологический анализ. CF, MC, SG и DS составили рукопись. CB, PM и DS завершили рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.
Финансирование
Это исследование было поддержано Министерством образования, университетов и исследований Италии (MIUR): Программа Dipartimenti di Eccellenza (2018–2022) — Департамент биологии и биотехнологии «L.Спалланцани », Университет Павии DS.
Конфликт интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Дополнительные материалы
Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.02767/full#supplementary-material
РИСУНОК S1 | Рекомбинационный анализ кластера 1 (A) , кластера 2 (B) и кластера 3 (C) .Анализ был выполнен с использованием программного обеспечения ClonalFrameML и включил эволюционно ближайший спорадический геном в качестве внешней группы.
РИСУНОК S2 | Последовательности вставки (IS), содержащие три эпидемических кластера. Эволюционно ближайший спорадический геном был добавлен в качестве эталона последним на рисунке для каждого кластера.
РИСУНОК S3 | Филогенетические деревья трех геномных кластеров [кластер 1 на панели (A) , кластер 2 на панели (B) и кластер 3 на панели (C) ], основанные на coreSNPs из глобального выравнивания, описанного на рисунке 1, определенный с помощью RAxML, с загрузкой 100, показывающий длины ветвей и количество пациентов.Для каждого кластера геном сестринской группы, как определено деревом на рисунке 1, использовался в качестве внешней группы.
РИСУНОК S4 | Филогенетическое сравнение контигов, несущих KPC, 32 изолятов. Контиг из изолята 1998, геном ST3985, четко отличается от контигов из штаммов ST512, принадлежащих к кластеру 1 (1897, 1935, 1955, 1961).
ТАБЛИЦА S1 | Профили чувствительности к противомикробным препаратам, определенные с помощью системы BD Phoenix 100 System на 32 исследованных штаммах Klebsiella pneumoniae .
ТАБЛИЦА S2 | Характеристики секвенированных геномов.
ТАБЛИЦА S3 | Прогнозируемые профили чувствительности к противомикробным препаратам, определенные с помощью инструмента Kleborate на 32 изолятах Klebsiella pneumoniae KPC.
ТАБЛИЦА S4 | Факторы 32 Klebsiella pneumoniae изолятов KPC.
Сноски
Список литературы
Адамс, М. Д., Бишоп, Б., и Райт, М.С. (2016). Количественная оценка влияния инсерционной последовательности на архитектуру бактериального генома. Microbial. Геном. 18: e000062. DOI: 10.1099 / mgen.0.000062
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Айрес, К. А. М., Айрес, да Консейсао-Нето, О. К., Таварес, Э., Оливейра, Т. Р., Диас, К. Ф. и др. (2017). Появление опосредованного плазмидой гена mcr-1 в клинической KPC-2-продуцирующей последовательности Klebsiella pneumoniae типа 392 в Бразилии. Антимикробный.Агенты Chemother. 61: e00317-17. DOI: 10.1128 / AAC.00317-17
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Банкевич А., Нурк С., Антипов Д., Гуревич А.А., Дворкин М., Куликов А.С. и др. (2012). SPAdes: новый алгоритм сборки генома и его приложения для секвенирования отдельных клеток. J. Comput. Биол 19, 455–477. DOI: 10.1089 / cmb.2012.0021
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бурер, А., Сайдел-Одес, Л., Ризенберг, К., Эскира, С., Пелед, Н., Натив, Р. и др. (2009). Приписываемый коэффициент смертности от устойчивой к карбапенемам бактериемии Klebsiella pneumoniae . Заражение. Control Hosp. Эпидемиол. 30, 972–976. DOI: 10.1086 / 605922
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Breurec, S., Guessennd, N., Timinouni, M., Le, T. T. H., Cao, V., Ngandjio, A., et al. (2013). Klebsiella pneumoniae , резистентная к цефалоспоринам третьего поколения в пяти африканских и двух крупных городах Вьетнама: многоклональная популяционная структура с двумя основными международными клональными группами CG15 и CG258. Clin. Microbiol. Заразить. 19, 349–355. DOI: 10.1111 / j.1469-0691.2012.03805.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Броберг, К. А., Паласиос, М., Миллер, В. Л. (2014). Klebsiella : предстоит пройти долгий путь к пониманию этого загадочного джетсеттера. F1000prime Rep. 6:64. DOI: 10.12703 / P6-64
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Каннателли, А., Джани, Т., Д’Андреа, М. М., Ди Пилато, В., Arena, F., Conte, V., et al. (2014). Инактивация Mgr B является обычным механизмом устойчивости к колистину у KPC-продуцентов Klebsiella pneumoniae клинического происхождения. Антимикробный. Агенты Chemother. 58, 5696–5703. DOI: 10.1128 / AAC.03110-14
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Караттоли А., Занкари Э., Гарсия-Фернандес А., Ларсен М. В., Лунд О., Вилла Л. и др. (2014). Выявление in silico и типирование плазмид с использованием PlasmidFinder и мультилокусное типирование последовательностей плазмид. Антимикробный. Агенты Chemother. 58, 3895–3903. DOI: 10.1128 / AAC.02412-14
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Cristina, M. L., Sartini, M., Ottria, G., Schinca, E., Cenderello, N., Crisalli, M. P., et al. (2016). Эпидемиология и биомолекулярная характеристика устойчивого к карбапенему Klebsiella pneumoniae в итальянской больнице. J. Prev. Med. Hyg. 57, E149 – E156.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Дарлинг, А.Э., Мау Б. и Перна Н. Т. (2010). прогрессивно-лиловый: множественное выравнивание генома с приростом, потерей и перестройкой генов. PLoS One 5: e11147. DOI: 10.1371 / journal.pone.0011147
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дэвид С., Рейтер С., Харрис С. Р., Гласнер К., Фелтуэлл Т., Аргимон С. и др. (2019). Эпидемия устойчивого к карбапенему Klebsiella pneumoniae в Европе вызвана нозокомиальным распространением. Nat. Microbiol. 4, 1919–1929.DOI: 10.1038 / s41564-019-0492-8
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
ДеЛео, Ф. Р., Чен, Л., Порселла, С. Ф., Мартенс, К. А., Кобаяши, С. Д., Портер, А. Р. и др. (2014). Молекулярное рассечение эволюции устойчивой к карбапенемам мультилокусной последовательности типа 258 Klebsiella pneumoniae . Proc. Natl. Акад. Sci. США 111, 4988–4993. DOI: 10.1073 / pnas.1321364111
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ди Мартино, П., Кафферини, Н., Жоли, Б., и Дарфей-Мишо, А. (2003). Пили Klebsiella pneumoniae типа 3 способствуют прилипанию и образованию биопленки на абиотических поверхностях. Res. Microbiol. 154, 9–16. DOI: 10.1016 / S0923-2508 (02) 00004-9
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Di Pilato, V., Arena, F., Tascini, C., Cannatelli, A., De Angelis, L.H., Fortunato, S., et al. (2016). mcr-1.2, новый вариант mcr, несущий переносимую плазмиду из штамма Klebsiella pneumoniae с типом последовательности 512, продуцирующего карбапенемазу KPC, устойчивого к колистину. Антимикробный. Агенты Chemother. 60, 5612–5615. DOI: 10.1128 / AAC.01075-16
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дидело, X., и Уилсон, Д. (2015). ClonalFrameML: эффективный вывод рекомбинации в целых бактериальных геномах. PLoS Comput. Биол. 11: e1004041. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1004041
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Европейский центр профилактики и контроля заболеваний [ECDC], (2016). Плазмид-опосредованная устойчивость к колистину у Enterobacteriaceae. Муниципалитет Сольна: ECDC.
Google Scholar
Европейский комитет по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам [EUCAST] (2016). Рекомендации по определению МИК колистина (полимиксина E), рекомендованные Объединенной рабочей группой CLSI-EUCAST по контрольным точкам полимиксина. Växjö: Европейский комитет по тестированию чувствительности к противомикробным препаратам.
Google Scholar
Гайарса, С., Командатор, Ф., Gaibani, P., Corbella, M., Dalla Valle, C., Epis, S., et al. (2015). Геномная эпидемиология Klebsiella pneumoniae в Италии и новое понимание происхождения и глобальной эволюции его устойчивости к карбапенемным антибиотикам. Антимикробный. Агенты Chemother. 59, 389–396. DOI: 10.1128 / AAC.04224-14
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гораши, З., Незами, Н., Хосейнпур-фейзи, Х., Гораши, С., Тебризи, Дж. С. (2011). Артрит, остеомиелит, сепсис и менингит, вызванные Klebsiella у новорожденного с низкой массой тела: отчет о болезни. J. Med. Case Rep. 5: 241. DOI: 10.1186 / 1752-1947-5-241
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Giakkoupi, P., Papagiannitsis, C.C., Miriagou, V., Pappa, O., Polemis, M., Tryfinopoulou, K., et al. (2010). Обновленная информация о развивающейся эпидемии bla KPC-2-переносчика Klebsiella pneumoniae в Греции (2009–10). J. Antimicrob. Chemother. 66, 1510–1513. DOI: 10.1093 / jac / dkr166
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гупта, С.К., Падманабхан, Б. Р., Диен, С. М., Лопес-Рохас, Р., Кемпф, М., Ландро, Л. и др. (2014). ARG-ANNOT, новый биоинформатический инструмент для обнаружения генов устойчивости к антибиотикам в бактериальных геномах. Антимикробный. Агенты Chemother. 58, 212–220. DOI: 10.1128 / AAC.01310-13
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ко, В. К., Патерсон, Д. Л., Саннимени, А. Дж., Хансен, Д. С., фон Готтберг, А., Мохапатра, С., и др. (2002). Внебольничная бактериемия Klebsiella pneumoniae : глобальные различия в клинической картине. Emerg. Заразить. Дис. 8, 160–166. DOI: 10.3201 / eid0802.010025
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лам, М. М., Вик, Р. Р., Уайрес, К. Л., Горри, К. Л., Джадд, Л. М., Дженни, А. В. и др. (2018). Генетическое разнообразие, мобилизация и распространение мобильного элемента ICEKp, кодирующего иерсиниабактин, в популяциях Klebsiella pneumoniae . Microb. Геном. 4: 9. DOI: 10.1099 / mgen.0.000196
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лю, Ю.Y., Wang, Y., Walsh, T.R., Yi, L.X., Zhang, R., Spencer, J., et al. (2016). Появление плазмид-опосредованного механизма устойчивости к колистину MCR-1 у животных и людей в Китае: микробиологическое и молекулярно-биологическое исследование. Lancet Infect. Дис. 16, 161–168. DOI: 10.1016 / S1473-3099 (15) 00424-7
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Марковская Р., Стоева Т., Шнайдер И., Боянова Л., Попова В., Дачева Д. и др. (2015). Клональное распространение мультилокусной последовательности типа ST 15, продуцирующей KPC-2 Klebsiella pneumoniae в Болгарии. APMIS 123, 887–894. DOI: 10.1111 / apm.12433
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мазерс, А. Дж., Пейрано, Г., и Питу, Дж. Д. Д. (2015). Роль плазмид эпидемической устойчивости и международных клонов высокого риска в распространении множественной лекарственной устойчивости Enterobacteriaceae . Clin. Microbiol. Rev. 28, 565–591. DOI: 10.1128 / CMR.00116-14
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Навон-Венеция, С., Кондратьева К., Караттоли А. (2017). Klebsiella pneumoniae : главный мировой источник устойчивости к антибиотикам. FEMS Microbiol. Ред. 41, 252–275. DOI: 10.1093 / femsre / fux013
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Нордманн П., Кузон Г. и Наас Т. (2009). Реальная угроза Klebsiella pneumoniae карбапенемаз-продуцирующих бактерий. Lancet Infect. Дис. 9, 228–236. DOI: 10.1016 / S1473-3099 (09) 70054-4
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Олайтан, А.О., Моран, С., Ролайн, Дж. М. (2014). Механизмы устойчивости к полимиксину: приобретенная и внутренняя устойчивость у бактерий. Фронт. Microbiol. 5: 643. DOI: 10.3389 / fmicb.2014.00643
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ондов Б. Д., Треанген Т. Дж., Мельстед П., Маллони А. Б., Бергман Н. Х., Корен С. и др. (2016). Mash: быстрая оценка расстояния между геномом и метагеномом с использованием MinHash. Genome Biol. 17: 132. DOI: 10.1186 / s13059-016-0997-x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Онори, Р., Gaiarsa, S., Comandatore, F., Pongolini, S., Brisse, S., Colombo, A., et al. (2015). Отслеживание внутрибольничных инфекций и вспышек Klebsiella pneumoniae с помощью полногеномного анализа: небольшой итальянский сценарий в рамках одной больницы. J. Clin. Microbiol. 53, 2861–2868. DOI: 10.1128 / JCM.00545-15
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Oteo, J., Pérez-Vázquez, M., Bautista, V., Ortega, A., Zamarrón, P., Saez, D., et al. (2016).Распространение KPC-продуцентов Enterobacteriaceae в Испании: WGS-анализ появляющихся клонов высокого риска Klebsiella pneumoniae ST11 / KPC-2, ST101 / KPC-2 и ST512 / KPC-3. J. Antimicrob. Chemother. 71, 3392–3399. DOI: 10.1093 / jac / dkw321
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Патель, Г., Хуприкар, С., Фактор, С. Х., Дженкинс, С. Г., и Калфи, Д. П. (2008). Результаты устойчивой к карбапенемам инфекции Klebsiella pneumoniae и влияние противомикробных и дополнительных методов лечения. Заражение. Control Hosp. Эпидемиол. 29, 1099–1106. DOI: 10.1086 / 5
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Podschun, R., and Ullmann, U. (1998). Klebsiella spp. как внутрибольничные возбудители: эпидемиология, систематика, методы типирования, факторы патогенности. Clin. Microbiol. Ред. 11, 589–603. DOI: 10.1128 / CMR.11.4.589
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ци, Ю., Вэй, З., Джи, С., Ду, X., Шен, П., и Ю, Ю. (2010). ST11, доминантный клон KPC-продуцента Klebsiella pneumoniae в Китае. J. Antimicrob. Chemother. 66, 307–312. DOI: 10.1093 / jac / dkq431
CrossRef Полный текст | Google Scholar
R Основная команда, (2013). R: язык и среда для статистических вычислений. Вена: Фонд R для статистических вычислений.
Google Scholar
Сабат, А.Дж., Будимир, А., Нашев, Д., Са-Леан, Р., Ван Дейл, Дж. М., Лоран, Ф. и др. (2013). Обзор методов молекулярного типирования для обнаружения вспышек и эпидемиологического надзора. Евронаблюдение 18: 20380.
Google Scholar
Sabbatucci, M., Iacchini, S., Iannazzo, C., Farfusola, C., Marella, A. M., Bizzotti, V., et al. (2017). Sorveglianza nazionale delle batteriemie da enterobatteri produttori di carbapenemasi. Отчет 2013–2016 гг. Rapporti ISTISAN 2017. Рим: Istituto Superiore di Sanità.
Google Scholar
Samuelsen, Ø, Naseer, U., Tofteland, S., Skutlaberg, D.H., Onken, A., Hjetland, R., et al. (2009). Появление клонально родственных изолятов Klebsiella pneumoniae с типом последовательности 258, продуцирующих плазмидопосредованную карбапенемазу KPC в Норвегии и Швеции. J. Antimicrob. Chemother. 63, 654–658. DOI: 10.1093 / jac / dkp018
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Shu, H.Y., Fung, C.P., Liu, Y.М., Ву, К. М., Чен, Ю. Т., Ли, Л. Х. и др. (2009). Генетическое разнообразие биосинтеза капсульного полисахарида у клинических изолятов Klebsiella pneumoniae . Микробиология 155, 4170–4183. DOI: 10.1099 / mic.0.029017-0
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Тумбарелло, М., Спану, Т., Сангинетти, М., Читтон, Р., Монтуори, Э., Леоне, Ф. и др. (2006). Инфекции кровотока, вызванные продуцирующей β-лактамазой расширенного спектра Klebsiella pneumoniae : факторы риска, молекулярная эпидемиология и клинические исходы. Антимикробный. Агенты Chemother. 50, 498–504. DOI: 10.1128 / AAC.50.2.498-504.2006
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Tzouvelekis, L. S., Miriagou, V., Kotsakis, S. D., Spyridopoulou, K., Athanasiou, E., Karagouni, E., et al. (2013). KPC-продуцирующий, обладающий множественной лекарственной устойчивостью Klebsiella pneumoniae , тип последовательности 258 как типичный условно-патогенный микроорганизм. Антимикробный. Агенты Chemother. 57, 5144–5146. DOI: 10.1128 / AAC.01052-13
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ван Белкум, А., Tassios, P. T., Dijkshoorn, L., Haeggman, S., Cookson, B., Fry, N. K., et al. (2007). Руководство по валидации и применению методов типирования для использования в бактериальной эпидемиологии. Clin. Microbiol. Заразить. 13, 1–46. DOI: 10.1111 / j.1469-0691.2007.01786.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Варани, А. М., Сигье, П., Гурбейр, Э., Шарно, В., и Чандлер, М. (2011). ISsaga — это набор сетевых методов для высокопроизводительной идентификации и полуавтоматической аннотации последовательностей вставок в геномах прокариот. Genome Biol. 12: R30. DOI: 10.1186 / GB-2011-12-3-r30
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Велков Т., Дай К., Чиккотосто Г. Д., Каппаи Р., Хойер Д. и Ли Дж. (2018). Полимиксины при инфекциях ЦНС: фармакология и нейротоксичность. Pharmacol. Ther. 181, 85–90. DOI: 10.1016 / j.pharmthera.2017.07.012
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Вилла, Л., Феуди, К., Фортини, Д., Яконо, М., Бонура, К., Эндимиани, А., и другие. (2016). Полная геномная последовательность KPC-3- и CTX-M-15-продуцирующих Klebsiella pneumoniae последовательность типа 307. Genome Announc. 4: e00213-16. DOI: 10.1128 / genomeA.00213-16
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ваттам А. Р., Дэвис Дж. Дж., Ассаф Р., Бойсверт С., Бреттин Т., Бун К. и др. (2016). Улучшения PATRIC, базы данных по бактериальной биоинформатике и аналитического ресурсного центра. Nucleic Acids Res. 45, D535 – D542.DOI: 10.1093 / nar / gkw1017
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Вэй, Д. Д., Ван, Л. Г., Дэн, К., и Лю, Ю. (2016). Появление KPC-продуцента Klebsiella pneumoniae гипервирулентного клона капсульного серотипа K1, который принадлежит к типу последовательности 11 в материковом Китае. Диагн. Microbiol. Заразить. Дис. 85, 192–194. DOI: 10.1016 / j.diagmicrobio.2015.03.012
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Занкари, Э., Hasman, H., Cosentino, S., Vestergaard, M., Rasmussen, S., Lund, O., et al. (2012). Выявление приобретенных генов устойчивости к противомикробным препаратам. J. Antimicrob. Chemother. 67, 2640–2644. DOI: 10.1093 / jac / dks261
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Свидетельства эпидемического распространения Enterobacterales, продуцирующих KPC, в чешских больницах
KPC-продуцирующих
EnterobacteralesВ течение 2018–2019 гг. В общей сложности 490 изолятов Enterobacterales с МИК меропенема> 0.125 мкг / мл были направлены в Национальную референс-лабораторию по антибиотикам (Прага) или в Биомедицинский центр (Пльзень) из 55 лабораторий. Все bla KPC -положительные изоляты (108) были подвергнуты дополнительному анализу, описанному ниже. Распределение лабораторий показано на Рисунке S1. Среди них 26 изолятов были идентифицированы как K. pneumoniae , 24 были идентифицированы как C. freundii , 18 были идентифицированы как комплекс Enterobacter cloacae , 14 были идентифицированы как Proteus mirabilis , 11 были идентифицированы как Morganella morganii и 10 были идентифицированы как E.coli . Пять оставшихся изолятов, продуцирующих KPC, принадлежали к бактериальным видам: Citrobacter farmeri (n = 1), Enterobacter aerogenes (n = 1), K. michiganensis (n = 2) и Klebsiella varicola (n = 1). = 1) (рисунок S2).
Анализ результатов секвенирования с коротким считыванием
Сорок девять из 108 продуцентов KPC, выбранных как представители всех различных больниц, видов бактерий и профилей восприимчивости, были охарактеризованы с помощью короткого считывания с использованием платформы MiSeq (Illumina).На основании данных короткого чтения, 44 из 49 секвенированных выделенных клеток содержали аллель bla KPC-2 (таблица S1), тогда как пять оставшихся изолятов несли ген bla KPC-3 . Аллель bla KPC-3 был идентифицирован среди 3 K . pneumoniae , 1 К . michiganensis и 1 E. coli . Помимо видоспецифичных хромосомных β-лактамаз, большинство клинических изолятов также несли гены, кодирующие оксациллиназы OXA-1/9 (n = 37) и / или пенициллиназы TEM-1 (n = 34).Ген bla CTX-M-15 был обнаружен среди 2 Enterobacter и 5 K . pneumoniae , а 4 из 5 P. mirabilis несли ген bla CTX-M-14 . Кроме того, 4 из 7 изолятов Enterobacter совместно несли ген, кодирующий карбапенемазу bla VIM-4 . Все секвенированные изоляты проявляли широкий спектр генов устойчивости, придающих устойчивость к аминогликозидам, сульфонамидам, триметоприму, макролидам, стрептограмину B, фосфомицину (низкий уровень устойчивости), фторхинолонам, хлорамфениколу, тетрациклинам и / или рифампицину (Таблица S1).Данные
WGS показали, что изолятов C. freundii принадлежали к типам последовательностей ST65 (n = 6), ST580 (n = 3), ST98 (n = 2) и ST8 (n = 1) (Таблица S1). Изоляты ST98 C. freundii , продуцирующие карбапенемазу KPC-2, ранее были выделены у пациентов в критическом состоянии, госпитализированных в Германии 17 , в то время как ST8 C. freundii , экспрессирующий изофермент VIM-4, был идентифицирован в Польше 18 в 2013 году. С другой стороны, новый ST580 был вариантом с одним аллелем ST142, который ранее был связан с продуцированием KPC-2 в изолятах из Университетской больницы Градец-Кралове (Чешская Республика) 16 .Изоляты, принадлежащие к комплексу E. cloacae , были отнесены к ST133 (n = 4) и ST421 (n = 3), которые ранее не были связаны с продукцией карбапенемазы KPC-2. Кроме того, in silico hsp60 типирование последовательностей генома показало, что четыре изолята Enterobacter принадлежали к виду Enterobacter гормухи 19 . Изоляты K. pneumoniae включали восемь ST. Семь производителей KPC-2 были распределены в ST101 (n = 4) и ST11 (n = 3).Остальные изоляты K. pneumoniae , продуцирующие KPC-2, принадлежали к уникальным ST (ST13, ST17 и ST147), тогда как изоляты K. pneumoniae , продуцирующие фермент KPC-3, были ST307, ST512 и ST846. ST11, ST101, ST147, ST307 и ST512 ранее были связаны с распространением механизма устойчивости к KPC и рассматривались как «клоны высокого риска» 20, 21 . Наконец, E. coli и K. michiganensis (близкородственный K.oxytoca ) были отнесены к различным ST, как показано в таблице S1. Поскольку схемы MLST не существуют для изолятов M. morganii и P. mirabilis , филогенетические кластеры для соответствующих изолятов были определены на основе выравнивания ядра-генома (см. Ниже) с использованием набора Harvest 22 .
Характеристика
bla Генетические единицы, несущие KPCНа основании данных короткого считывания было отобрано 25 изолятов, продуцирующих KPC, для секвенирования с помощью платформы Sequel I в попытке закрыть плазмидные последовательности.Все 25 изолятов показали устойчивость к цефалоспоринам и эртапенему, в то время как (за исключением изолята P. mirabilis ) оставались чувствительными к колистину. Были замечены некоторые различия в значениях MIC, однако это связано с различным содержанием генов устойчивости к антибиотикам, обнаруженных в каждом изоляте (Таблица S3). Анализ данных секвенирования с длительным считыванием показал присутствие нескольких плазмидных последовательностей, несущих bla KPC , принадлежащих к разным группам Inc и представляющих различные размеры (Таблица S2).На основании анализа плазмидных последовательностей PlasmidFinder 19 из 25 плазмид, несущих bla KPC , можно отнести к R (n = 12), N (n = 5), C (n = 1) и P6 (n = 1) группы несовместимости (Inc) (Рисунок S3). Пять из оставшихся плазмид, несущих bla KPC , были мультирепликонами, в то время как одна плазмида не могла быть типизирована в базе данных. Все плазмиды, за исключением репликонов IncN, содержали изоформу Tn 4401a транспозона Tn 4401 , которая аналогична описанной в плазмиде pNYC, но не на 100 п.н. выше bla гена KPC 11 .
Три из 12 плазмид, несущих bla KPC , принадлежащих группе IncR, имели размер ~ 54 т.п.н., а девять оставшихся плазмид IncR имели размер ~ 89 т.п.н. Плазмиды IncR размером ≥54 т.п.н. были производными плазмиды pCfr-31816cz, кодирующей IncR KPC-2 (рис. 1a), которая была охарактеризована во время вспышки Enterobacterales , продуцирующей KPC-2, в чешской больнице ( Градец Кралове) 16 . Однако они отличались от pCfr-31816cz наличием дополнительной последовательности длиной 9232 п.н. (нуклеотиды от 7286 до 16517; номер доступа в GenBank.CP070521), кодирующий систему токсин-антитоксин CcdAB, и белки IncFIIA RepA и Ssb. С другой стороны, плазмиды IncR размером ≥89 т.п.н. показали высокую степень сходства друг с другом и с ранее описанной плазмидой pCfr-36049cz (фиг. 1b). Плазмида pCfr36049cz была охарактеризована во время вспышки KPC-2, которая произошла в Градец Кралове 16 в течение 2014–2016 годов. Подобно pCfr-36049cz, последние плазмиды представляли собой гибридные производные IncR bla KPC-2 -положительных плазмид и сегмента, производного от типа IncN3.Однако, в отличие от pCfr-36049, была найдена полная система переноса IncN3, объясняющая способность pA4411_KPC, p46506_KPC, p52260_KPC, p52808_KPC, p52810_KPC, p52812_KPC, p52813_KPC, p53083_KPC и p53415_KPC передавать через конъюгирование. Следует отметить, что плазмида IncR p52813_KPC несла аллель bla KPC-3 , что указывает на продолжающуюся эволюцию детерминант, кодирующих карбапенемазы KPC.
Рисунок 1Сравнение BRIG плазмид, кодирующих IncR KPC, охарактеризованных из изолята Enterobacterales , полученных из чешских больниц.
Плазмида p48659_KPC представляет собой гибридную производную p52810_KPC и pMmo-37590cz (рис. 2). pMmo-37590cz представляет собой плазмиду, кодирующую IncP6 KPC-2, которая также была охарактеризована во время вспышки KPC-2 в больнице Градец Кралове 16 . Плазмида p48659_KPC содержит последовательность из 50 603 пар оснований (нуклеотиды с 5917 по 56 519), кодирующую KPC-2, которая идентична частичной последовательности p52810_KPC. Оставшаяся последовательность p48659_KPC длиной 11723 п.н. состоит из одного сегмента, имеющего большое сходство с последовательностями, несущими pMmo-37590cz.Этот сегмент включает ген репликации IncP6 repA , гены разделения, parA , parB и parC , а также гены, кодирующие ДНК-инвертазу / рекомбиназу ( int ), дезоксиметилтрансферазу () dmt , dmt , и ДНКазу ( drn ) модуля ограничения типа II. Анализ последовательности показал, что плазмида p45182_KPC, которая не была типизирована с помощью PlasmidFinder, имеет размер 50 582 п.н. и является производным p52810_KPC (рис. 2). Наблюдались только два различия между двумя плазмидами.Сегмент длиной 26 069 п.о. (нуклеотиды от 34 454 до 60 522 в p52810_KPC), включая плазмидный каркас IncR, фрагмент, подобный Tn 1721 (состоящий из инвертированного повтора транспозона длиной 38 п.н., tnpA , tnpR и tnpR ), и intI1 ген интегрона В 37 не присутствовал в p45182_KPC. Кроме того, второй фрагмент (нуклеотиды 65,142-83,473 в p52810_KPC) размером 18,332 п.н., который содержал область vir2 / 3/4/9/10/11 vir2 / 3/4/9/10/11, -область IncN3-подобных плазмид также отсутствовал в p45182_KPC, что, вероятно, объясняет неспособность плазмиды конъюгировать.
Фигура 2Линейные сравнения плазмид p48659_KPC и p45182_KPC, кодирующих KPC. Стрелки показывают направление транскрипции открытых рамок считывания (ORF). Гены устойчивости показаны красным. Элементы IS и транспозазы показаны желтым и светло-зеленым цветом соответственно. intI1 гены заштрихованы фиолетовым. Гены, кодирующие системы репликации, стабильности и переноса, показаны голубым, синим и зеленым цветами соответственно. Остальные гены показаны серым цветом. Гомологические сегменты (представляющие ≥ 85% идентичности последовательностей) обозначены серой штриховкой.
IncN bla KPC-2 -положительные плазмиды, которые были отнесены к ST15 на основе pMLST (https://cge.cbs.dtu.dk/services/pMLST/), включали плазмидную основу и Область множественной лекарственной устойчивости (MDR) вставлена после fipA . Плазмидный каркас IncN содержал область репликации ( repA ), систему переноса ( traA / B / C / D / N / E / O / F / G ), оперон стабильности ( stbA / B / C ). ) и антистрикционной системой ( ardA / B ).Область MDR плазмид IncN, размер которой варьировался от 21 011 до 31 420 п.н., содержал полученный из Tn 4401 фрагмент длиной 2833 п.н., кодирующий карбапенемазу KPC-2. По сравнению с Tn 4401b , последовательность, производная Tn 4401 (обозначенная Tn 4401 j), имела делецию 217 п.н., обнаруженную перед bla KPC-2 . Фрагмент, производный от Tn 4401 , был разрушен последовательностью, подобной Tn 3 , на 111 п.н. выше bla KPC-2 .Последовательность, подобная Tn 3 , состояла из инвертированного повтора (IR) транспозона и гена устойчивости bla TEM-1 . Аналогичная генетическая среда, несущая bla KPC-2 , была ранее идентифицирована в плазмиде IncN pCF8698_KPC2, охарактеризованной из штамма C. freundii , выделенного в Германии (номер доступа в GenBank LN610760) (рисунок S4). Область MDR плазмид IncN проявляла дополнительные гены, обеспечивающие устойчивость к аминогликозидам, сульфонамидам, триметоприму, макролидам и / или фторхинолонам (таблица S2, фигура S4).
Плазмида p49969_KPC, типизированная как IncC на основе PlasmidFinder, проявляла наибольшее сходство с плазмидой pCf3880, кодирующей OXA-204 (охват 74%, идентичность 99,87%) (фиг. S5). PCf3880, представляющая собой гибридную плазмиду IncFII / FIB / C 2 , была охарактеризована из C. freundii , выделенной из больницы в Канаде 23 . В отличие от pCf3880, плазмида p49969_KPC несла ген, кодирующий карбапенемазу, bla KPC-2 , который возник в результате приобретения фрагмента длиной 29,121 п.н.CP070549), демонстрируя большое сходство с плазмидой IncN p48846_KPC. Фрагмент, производный от IncN, был связан двумя копиями инсерционной последовательности IS 26 в параллельной ориентации, образуя составной транспозон. Плазмида p49969_KPC также несла гены устойчивости bla TEM-1B , aac (6 ‘) -Im , aac (3) -IId и aph (2′ ‘) -Ib .
Плазмиды pA9853_KPC, p47693_KPC и p51248_KPC, которые были охарактеризованы по ST101 K.pneumoniae (таблица S2), проявляли значительное сходство с pIT-12C73 20 и безымянной плазмидой 3 (номер доступа в GenBank CP033628) (фиг. 3). Плазмида pIT-12C73, которая также была охарактеризована из ST101 K. pneumoniae , выделенной в Италии в 2011 году, представляла собой мультирепликонную плазмиду IncFII K2 -IncR KPC. Плазмиды pA9853_KPC и p51248_KPC отличались от pIT-12C73 приобретением фрагмента длиной 3254 п.н., содержащего ген repE IncFIA . Плазмида pA9853_KPC содержала дополнительную последовательность длиной 9295 пар оснований, идентичную ColE1-подобной плазмиде pColRNAI-Kp1-1 (номер доступа в GenBank.LC505458). Сравнительный анализ показал, что события рекомбинации, опосредованные IS 26 , вероятно, играли основную роль в приобретении фрагментов различного происхождения. Аналогично, для pIT-12C73, помимо bla KPC-2 , плазмиды pA9853_KPC, p47693_KPC и p51248_KPC также несли bla TEM-1 , armA , mphE , устойчивость mphE (рис. . 3). Интересно, что дупликация транспозона, кодирующего KPC-2, Tn 4401a , была обнаружена в плазмиде p51428_KPC.
Фигура 3Линейное сравнение плазмид p51248_KPC, pA9853_KPC и p47693_KPC, кодирующих мультипликон KPC. Стрелки показывают направление транскрипции открытых рамок считывания (ORF). Гены устойчивости показаны красным цветом, а гены устойчивости к ртути — коричневым. Элементы IS и транспозазы показаны желтым и зеленым цветом соответственно. intI1 гены заштрихованы фиолетовым. Гены, кодирующие системы репликации, стабильности и переноса, показаны голубым, синим и зеленым цветами соответственно.Остальные гены показаны серым цветом. Гомологические сегменты (представляющие ≥ 85% идентичности последовательностей) обозначены серой штриховкой.
Плазмида p51483_ΚPC, которая содержала репликоны FIB K и FII K , показала наибольшее сходство с плазмидой pRIVM_C008981_1, кодирующей KPC-2 (охват 96%; идентичность 99,93%) (Рисунок S6a), охарактеризованной на основе K. pneumoniae Изолят , собранный в рамках национального надзора Нидерландов 24 . Аналогично pRIVM_C008981_1, кроме регионов, ответственных за конъюгативный перенос ( traX / I / D / T / S / G / H / F / B / Q / C / U / W / V / P / K / Y / M ) и поддержание плазмиды (опероны psiA / B , parA / B и umuD / C ), p51483_ΚPC несет гены silE / S / R / C / B / A / P , кодирующие АТФазу, экспортирующую серебро, pcoA / B / C / D / R / E участвует в сопротивлении меди, arsH / D / A / C / B / A / D / R обеспечивает сопротивление мышьяку и fecI / R / A / B / C / D / E участвует в транспорте дицитрата Fe (3 +).В дополнение к bla KPC-2 , плазмида p51483_ΚPC содержала bla TEM-1 , aadA2 , aph (3 ‘) -Ia , catA1 dphr и catA1 , гена устойчивости. Наконец, плазмида p51059_KPC, выделенная из ST512 K. pneumoniae , показала высокое сходство с плазмидами, кодирующими IncFII K2 KPC-2, pGR-1504 (охват 99%; идентичность 99,97%) и pIT-01C22 (охват 99%; идентичность) 99,96%) (рис. S6b), характерных для двух эндемичных регионов, Греции и Италии, в течение 2010–2011 гг. 20 .Плазмиды pGR-1504 и pIT-01C22 были производными архетипической плазмиды pKpQIL, кодирующей IncFII K2 KPC, первоначально описанной в изоляте ST258 K. pneumoniae Kpn557 25 .
Сравнение геномов и родство
Данные последовательностей из 49 секвенированных изолятов были использованы для исследования их геномного родства с глобальными изолятами, и филогении на основе SNP были построены соответствующим образом. Для P. mirabilis пять секвенированных изолятов сравнивали с 582 геномами, обнаруженными в базе данных NCBI (рис.4). Четыре изолята (Pmi-52808, Pmi-52812, Pmi-53415 и Pmi-52260) сгруппированы вместе, образуя кладу. Эти изоляты были выделены из той же больницы (Нью-Йорк) и с использованием Pmi-52260 в качестве эталона для обнаружения SNP, Pmi-52808 и Pmi-53415 имели 14 и 9 изменений (snps, del / ins), соответственно, а Pmi-52812 — 117. изменения (Таблица S4). Наконец, Pmi-45467, выделенный в больнице HK, был относительно удален от остальных изолятов.
Рисунок 4 Филогения на основеSNP пяти P.mirabilis с 582 геномами, загруженными из базы данных NCBI. Красные узлы указывают на изоляты из исследования. Серые треугольники указывают на свернутые узлы.
Аналогично 92 М . morganii доступных генома в базе данных NCBI были загружены для сравнения их с пятью изолятами, секвенированными в этом исследовании (рис. 5). Mmo-48659, выделенный в больнице HK, сгруппировался отдельно в уникальный узел. Однако он был тесно связан с изолятом из Южной Африки (790 изменений). С другой стороны, четыре изолята (изолированные из трех разных больниц; таблица S1) сгруппировались вместе, причем Mmo-51087 и Mmo-50821, выделенные из той же больницы, образовали субклад.Для обнаружения SNP среди четырех изолятов этой клады Mmo-51087 использовали в качестве эталона. Mmo-50821 и Mmo-46544 показали 22 и 62 изменения, соответственно, а Mmo-46903 — 222 изменения (Таблица S4).
Рисунок 5 Филогения на основеSNP пяти M. morganii с 92 геномами, загруженными из базы данных NCBI. Красные узлы указывают на изоляты из исследования.
Для C. freundii из базы данных NCBI было загружено 118 геномов, чтобы сравнить их с 12 секвенированными изолятами (рис.6). Геномы трех изолятов (Cfr-46338, Cfr-49942 и Cfr-48658), которые принадлежали ST580 и были извлечены из больницы HK, сгруппированы вместе, образуя кладу. Обнаружение SNP среди этих изолятов показало, что Cfr-49942 и Cfr-46338 имели 93 и 111 изменений, соответственно, по сравнению с Cfr-48658. В близкородственной кладе еще шесть геномов из изолятов ST65 Cfr-50935, Cfr-48846, Cfr-51238, Cfr-47462, Cfr-48294 и Cfr-47299 сгруппированы вместе. Обнаружение SNP по сравнению с Cfr-50935 показало, что Cfr-48846 имел 25 изменений, в то время как Cfr-51238, Cfr-47462, Cfr-47299 и Cfr-48294 имели 47, 57, 88 и 99 соответственно (Таблица S4).С другой стороны, геномы двух изолятов ST98, Cfr-48736 и Cfr-49141, сгруппированы вместе в довольно отдаленную кладу. Эти изоляты сгруппированы вместе с другими изолятами ST98 C. freundii из США и Великобритании. Обнаружение SNP показало, что Cfr-48736 имеет 28 изменений по сравнению с Cfr-49141. Наконец, изолят Cfr-49969, который был отнесен к ST8, привел к уникальному узлу.
Рисунок 6 Филогения на основеSNP 12 C. freundii с 118 геномами, загруженными из базы данных NCBI.Красные узлы указывают на изоляты из исследования. Серые треугольники указывают на свернутые узлы.
Для Enterobacter гормон , 126 геномов были загружены из базы данных NCBI и сравнивались с семью изолятами, секвенированными в ходе этого исследования (рис. 7). Изоляты сгруппированы в две клады. Первая клада содержала четыре изолята (Ecl-49142, Ecl-48587, Ecl-48293 и Ecl-49583). Ecl-48293 использовался в качестве эталонного генома для обнаружения SNP среди этих четырех изолятов. Ecl-49142 — 26, Ecl-48587 — 34, а Ecl-49583 — 32 изменения.Все изоляты ST133, полученные из Чехии, Южной Африки, Японии, Австралии и Египта, были сгруппированы в уникальный кластер. Кроме того, другой кластер содержал три изолята (Ecl-51693, Ecl-51846 и Ecl-52075), которые были ST421. Для обнаружения SNP Ecl-51846 использовался в качестве эталона, показывая, что Ecl-52075 и Ecl-51692 имели 12 и 14 изменений, соответственно (Таблица S4).
Рисунок 7 Филогения на основеSNP семи E. homaechei с 126 геномами, загруженными из базы данных NCBI.Красные узлы указывают на изоляты из исследования. Серые треугольники указывают на свернутые узлы.
Для K. pneumoniae было загружено 732 генома из базы данных NCBI для сравнения их с 13 секвенированными изолятами (рис. 8). Изоляты Kpn-51835, Kpn-47158, Kpn-51483, Kpn-53027, Kpn-52813 и Kpn-51069, которые были назначены разным ST, образовали каждый уникальный отдельный узел. Одна клада, состоящая из Kpn-47693, Kpn-O141 и Kpn-A9853, находилась в непосредственной близости с Kpn-51248 в соседнем кластере.Используя Kpn-47693 в качестве эталонного генома для обнаружения SNP, Kpn-O141, Kpn-A9853 и Kpn-51248 имели 25, 22 и 100 изменений соответственно. Вышеупомянутые изоляты были сгруппированы вместе с другими изолятами ST101 из Италии, США, Японии, Индии и Южной Африки. Последние три изолята K. pneumoniae (Kpn-52810, Kpn-A4411 и Kpn-45128) сгруппированы вместе. При использовании Kpn-52810 в качестве эталонного генома для обнаружения SNP, Kpn-A4411 имел 27 изменений, в то время как Kpn-45128 показал 816 изменений (Таблица S4).Интересно, что последние изоляты были объединены с изолятами из Китая, Швейцарии, Индии и США, которые также принадлежали к ST11.
Рисунок 8Филогения 13 K на основе SNP. pneumoniae с 732 геномами, загруженными из базы данных NCBI. Красные узлы указывают на изоляты из исследования. Серые треугольники указывают на свернутые узлы.
Фенотипический и ферментативный сравнительный анализ вариантов KPC, KPC-2 и его недавно обнаруженного варианта KPC-15
Abstract
Сообщалось о шестнадцати различных вариантах (от KPC-2 до KPC-17) в семействе KPC, и большинство текущих исследований сосредоточено на KPC-2 и KPC-3.Вариант KPC-15, выделенный из Klebsiella pneumoniae в китайской больнице, был недавно обнаруженным ферментом KPC. Для сравнения характеристик KPC-15 и KPC-2 варианты определяли путем тестирования чувствительности, ПЦР-амплификации и секвенирования, а также изучения кинетических параметров. Штамм, несущий KPC-15, показал устойчивость к 18 обычным противомикробным агентам, особенно к антибиотикам кабапенема, а штамм, включающий KPC-2, также показал устойчивость к антибиотикам кабапенема, но оба штамма были чувствительны к полимиксину B и колистину.Эксперименты по конъюгации показали, что изменения значений MIC для антибиотиков были связаны с перенесенными плазмидами. Различия аминокислот были охарактеризованы по сайтам 119 лейцина и 146 лизина с KPC-15 и KPC-2. Минимальное дерево эволюции показало эволюцию аллелей KPC и показало, что KPC-15, по-видимому, был в значительной степени гомогенен с KPC-4. Установившиеся кинетические параметры показали, что каталитическая эффективность KPC-15 была выше, чем у KPC-2, для всех протестированных антибиотиков в этом исследовании.Каталитическая эффективность KPC-15, вызывающая устойчивость к β-лактамным антибиотикам, была выше, чем у KPC-2. Между тем, эволюционная трансформация изменила KPC с эффективной карбапенемазы на ее варианты (KPC-15) с лучшей каталитической эффективностью цефтазидимазы, а старые антибиотики полимиксин B и колистин могут играть роль в терапии мультирезистентных штаммов.
Образец цитирования: Wang D, Chen J, Yang L, Mou Y, Yang Y (2014) Фенотипический и ферментативный сравнительный анализ вариантов KPC, KPC-2 и его недавно обнаруженного варианта KPC-15.PLoS ONE 9 (10): e111491. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111491
Редактор: Хосе М. Санчес-Руис, Университет Гранады, Испания
Поступила: 19 июля 2014 г .; Принята к печати: 29 сентября 2014 г .; Опубликовано: 31 октября 2014 г.
Авторские права: © 2014 Wang et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Данные доступны в GenBank по инвентарному номеру KC433553.
Финансирование: Это исследование было поддержано грантами Чжэцзянского фонда естественных наук (Y2100248), Фонда Департамента науки и технологий провинции Чжэцзян (2014C33153), Фонда Департамента здравоохранения Чжэцзяна (2014KYB313), Основание Тайчжоуского научно-технического бюро (1102KY15, 1201KY22 и 1301KY36) и фонда Цзяоцзянского научно-технического бюро Тайчжоу (83041 и 112071), Китай.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.
Введение
Все чаще сообщается о недавнем появлении и распространении приобретенной устойчивости к карбапенемам у грамотрицательных бактерий, что приводит к большему количеству клинических неудач в борьбе с инфекциями. Карбапенем-устойчивые Enterobacteriaceae обычно устойчивы не только к β-лактамным антибиотикам, но и к большинству других классов противомикробных агентов [1].
Устойчивость к карбапенемам у грамотрицательных бактерий часто наблюдается из-за высокой экспрессии β-лактамаз AmpC, что связано с потерей белков внешней мембраны [2], повышенной экспрессией систем оттоковых насосов [3] и с изменение сродства пенициллин-связывающих белков (PBP) к карбапенемам [4]. Устойчивость к карбапенемам может быть в первую очередь опосредована ферментами, гидролизующими карбапенем, такими как металло-β-лактамазы (MBL), карбапенемазы Гвианы расширенного спектра (GES) и Klebsiella pneumoniae карбапенемазы (KPC) [5] — [7].
KPC был впервые обнаружен в клиническом изоляте K. pneumoniae , собранном в Северной Каролине в 2001 г. [8]. После этого аминокислотный вариант KPC-1, названный KPC-2, был обнаружен в Klebsiella spp. [9], [10] и Salmonella enterica [11]. Однако недавнее исправление последовательности bla KPC-1 показало, что последовательности из bla KPC-1 и bla KPC-2 идентичны, поэтому KPC-1 и KPC- 2 — те же ферменты [8].Мутации в гене bla KPC-2 привели к двум вариантам: bla KPC-3 [12] и bla KPC-4 [13]. С тех пор KPC были обнаружены у нескольких представителей Enterobacteriaceae и обнаружены в регионах Америки, Азии, Европы и Ближнего Востока [7], [14] — [20].
В настоящее время сообщается о шестнадцати различных вариантах (от KPC-2 до KPC-17) в семействе KPC, и большинство текущих исследований сосредоточено на KPC-2 и KPC-3 [21] — [23].В ходе исследования мы охарактеризовали фенотипический и ферментативный сравнительный анализ фермента KPC-2 и нового варианта KPC-15, который был недавно открыт нами [24].
Материалы и методы
Утверждение комитета по этике
Это исследование было одобрено этическим комитетом городской больницы Тайчжоуского университета, и от каждого из участников было получено письменное информированное согласие. Право на объекты исследования было защищено, и мы согласились, что исследование проводилось в нашей больнице.
Штаммы бактерий
Два штамма K. pneumoniae , которые были пронумерованы Kp1769 и Kp1241, были выделены из образцов мокроты и крови соответственно. Штамм Kp1241 был выделен из гепатобилиарного отделения в июне 2012 года, а штамм Kp1769 был выделен из отделения интенсивной терапии в сентябре 2011 года в отделении дыхания городской больницы Тайчжоу Тайчжоуского университета. Штамм Kp1769, который был подтвержден с участием гена bla KPC-2 , был использован для сравнения характеристик кинетических параметров с недавно обнаруженным вариантом bla KPC-15 в этом исследовании.Эти два штамма были отнесены к K. pneumoniae с использованием карты Vitek GNI + (bioMérieux, Франция), а идентификация видов была подтверждена анализом последовательности 16 S-23 S рРНК (Midi Labs, США).
Тестирование чувствительности к противомикробным препаратам и эксперименты по конъюгации
МИК 20 противомикробных препаратов, включая имипенем, меропенем, эртапенем, ампициллин, азтреонам, цефазолин, цефепим, цефтазидим, цефтриаксон, ципрофлоксацин, левофлоксацин, амикацин, тобрамицин / цеппералспактин, цеппералспактин, цеппералспактин, цеппералспактин. , полимиксин B и колистин в штаммах E.coli J53Az R , Kp1241, Kp1769 и трансконъюганты определяли с использованием метода разбавления бульона Micro-Scan (США) с помощью планшетов. Escherichia coli ATCC 25922 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 использовали в качестве контролей. Результаты интерпретировали согласно CLSI (2012) [25].
Согласно ранее описанному протоколу [26], эксперименты по конъюгации были выполнены в лизогенном бульоне (LB) со штаммом E. coli J53Az R (устойчивость к азиду натрия) в качестве реципиента и со штаммами Kp1241 и Kp1769 в качестве реципиента. донорские штаммы.Донорские и реципиентные клетки в логарифмической фазе (по 0,5 мл каждой) добавляли к 4 мл свежего LB, после чего инкубировали при 35 ° C в течение 18–24 ч без встряхивания. Трансконъюганты отбирали на чашках с триптиказо-соевым агаром (TSA), содержащим азид натрия (0,3 г / л) и имипенем (0,02 г / л), после инкубации в течение 18–24 ч при 35 ° C.
ПЦР-амплификация и секвенирование
ПЦР выполняли для амплификации и секвенирования pre- bla KPC-15 , варианта bla KPC-15 и окружающих его генов ( bla TEM , tnpA и tnpA). ) в К.pneumonae с использованием праймеров, показанных в таблице 1. ПЦР также выполняли для амплификации трансформанта, конъюгированного с E. coli J53Az R . Праймеры были синтезированы Sangon Biological Technology (Шанхай, Китай). Условия ПЦР для варианта pre- bla KPC-15 и bla KPC-15 были следующими: 3 мин при 94 ° C и 30 циклов по 1 мин при 94 ° C, 1 мин при 52 ° C. ° C и 1 мин при 72 ° C, после чего следовала стадия удлинения в течение 10 мин при 72 ° C, в результате чего получали полосу примерно1431 п.н. для bla KPC-15 , охватывая всю область кодирования KPC. Такие же условия ПЦР использовали для амплификации генов bla TEM , tnpA (IS Kpn8 и IS Kpn6-, подобные транспозазам) и tnpR генов. Праймеры tnpA 1 , tnpA 2 и tnpA 3 использовали для амплификации транспозона IS Kpn8 , а праймер tnpA использовали для амплификации транспозона, подобного IS Kpn6-.Положительные продукты ПЦР также были секвенированы компанией Sangon Biological Technology (Шанхай, Китай). Затем результаты секвенирования были собраны с использованием программного обеспечения contigExpress Program, и последовательности были получены для генетической среды варианта bla KPC-15 из штамма Kp1241.
Плазмидывыделяли из штамма Kp1241 с использованием набора Axygen (США) в соответствии с инструкциями производителя. Затем плазмиды разделяли электрофорезом через 0.6% агарозный гель в присутствии буфера 1 × TBE при постоянном напряжении 90 В в течение 90 мин. Эти фрагменты плазмидной ДНК служили образцами для амплификации гена bla KPC-15 с помощью ПЦР, где определяли начальное положение плазмиды гена bla KPC-15 . Расчетные размеры плазмидных ДНК определяли согласно [26]. Основываясь на этих данных, мы картировали генетическую последовательность областей bla KPC-15 выше и ниже по течению и определили стартовые сайты транскрипции и промоторные области соответствующих генов.
Препарат β-лактамазы и кинетические параметры для сравнения KPC-15 и KPC-2
Культуры K. pneumoniae , несущие bla KPC-15 и bla KPC-2 , выращивали в течение ночи при 37 ° C в 100 мл триптиказо-соевого бульона с амоксициллином (100 мг / мл). Бактериальные суспензии разрушали обработкой ультразвуком (20 с при 20 кГц × 4 раза) и центрифугировали (30 мин, 20000 g, 4 ° C). Собирали супернатанты, содержащие неочищенные экстракты ферментов.Затем неочищенные экстракты ферментов смешивали с 50 мМ Трис-Cl, pH 7,4, с 1 мМ сульфатом магния и лизировали лизоцимом 40 мг / л. Затем для переваривания нуклеиновых кислот добавляли 1,0 ед. / Мл бензоназной нуклеазы и добавляли ЭДТА в концентрации 2,0 мМ для завершения периплазматического фракционирования. Лизированные клетки центрифугировали при 12000 об / мин в течение 10 минут для удаления клеточного дебриса. Супернатант был дополнительно обогащен и очищен от β-лактамазы с использованием препаративного изоэлектрического фокусирования, как описано ранее [27], [28].Стадия очистки β-лактамазы выполнялась в соответствии со ссылкой [29].
Установившиеся кинетические параметры определяли с помощью спектрофотометра с диодной матрицей (Agilent, США). Каждый анализ выполняли с 10 мМ PBS, pH 7,4, при 25 ° C. Во всех анализах фермент поддерживали на уровне 10 нМ, тогда как концентрации субстрата варьировали от 50 до 200 мкМ. Кинетические анализы были выполнены в стационарных условиях для определения kms и kcats противомикробных агентов: имипенема, меропенема, цефтазидима, цефотаксима, цефепима, азтреонама и нитроцефина для фермента в соответствии с ранее установленной моделью, представленной в уравнении кинетических параметров [30 ], [31] и ссылку [29].Концентрации имипенема варьировали от 25 до 250 мкМ; От 50 до 250 мкМ для меропенема; От 150 до 500 мкМ для цефтазидима; От 100 до 500 мкМ для цефотаксима; От 250 мкМ до 1,5 мМ для цефепима; и от 50 мМ до 500 мМ для азтреонама. Конечную концентрацию нитроцефина 100 мкМ использовали в качестве репортерного субстрата.
Результаты
Тестирование чувствительности к противомикробным препаратам и эксперимент по конъюгации
МИК 20 противомикробных агентов для штаммов Kp1241 и Kp1769 представлены в таблице 2.Результаты показали, что штамм Kp1241 был устойчив к 18 антимикробным агентам и, в частности, демонстрировал высокие значения MIC для имипенема, меропенема и эртапенема — 16, 16 и 32 мкг / мл соответственно; однако штаммы Kp1769 показали значения MIC для имипенема, меропенема и эртапенема, равные 2, 2 и 4 мкг / мл соответственно. И штамм Kp1241 остался чувствительным к полимиксину B и колистину, так же как и штамм Kp1769. По результатам экспериментов по конъюгации трансконъюгант штамма Kp1241 проявил фенотип устойчивости к имипенему, меропенему, эртапенему, цефалоспорину, аминогликозидам, ампициллину / сульбактаму, пиперациллин / тазобактаму и цефоперазону / трансконьюгенту Kp1241, что указывало на значения интермедиата импенема / сульбмедактама69, но указывали на значения интермедиата импенема / сульбмедактама69, но , меропенем и эртапенем.Следовательно, результаты экспериментов по конъюгации показали, что изменения значений MIC антибиотиков были вызваны перенесенными плазмидами.
Аминокислотные вариации, минимальное дерево эволюции аминокислотных последовательностей и кинетические параметры для KPC-15 и других ферментов KPC
Аминокислотные вариации между новым bla KPC-15 и другими bla генами KPC были перечислены на рисунке 1, и на основе данных рисунка 1 мы построили минимальное дерево эволюции аминокислотных последовательностей для KPC. -2 в KPC-17 (Рисунок 2) с использованием MEGA 5.05 программное обеспечение. Дерево, очевидно, указывало на эволюцию аллелей KPC и показало, что KPC-15 оказался в значительной степени гомогенным с KPC-4.
Рисунок 1. Сравнение выравнивания аминокислотных последовательностей карбапенемаз KPC.
KPC-15 был недавно идентифицирован как карбапенемаза в Klebsiella pneumonae из городской больницы Тайчжоу в Китае. Данные в круглых скобках являются инвентарными номерами GenBank.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111491.g001
Рисунок 2. Минимальное дерево эволюции аминокислотных последовательностей от KPC-2 до KPC-17.
Карбапенемаза KPC-15 была обнаружена нами недавно и оказалась почти гомогенной с KPC-4. Аминокислотные последовательности KPC основаны на данных фиг.1. Это сравнение было разработано и проанализировано с использованием программного обеспечения MEGA 5.05.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111491.g002
Кинетические параметры в установившемся состоянии были измерены пять раз и усреднены, как показано в таблице 3.В соответствии с данными МИК, каталитическая эффективность (отношение ккат / км) фермента KPC-15 была самой низкой для цефтазидима, 0,0142 мкМ -1 с -1 , и была выше в 5,26 раза по сравнению с таковой для фермент KPC-2 при 0,0027 мкМ -1 с -1 . Однако каталитическая эффективность фермента KPC-15 была самой высокой для нитроцефина, при 9,2 мкМ -1 с -1 , и была немного выше, в 1,10 раза по сравнению с ферментом KPC-2, при 8,4. мкМ -1 с -1 .Каталитическая эффективность фермента KPC-15 была выше в 2,96 раза для имипенема, со значением 2,81 мкМ -1 с -1 , по сравнению с эффективностью фермента KPC-2 при 0,95 мкМ -1. с −1 . Кроме того, каталитическая эффективность фермента KPC-15 была также выше в 2,72 раза для меропенема, со значением 0,68 мкМ -1 с -1 , по сравнению с эффективностью фермента KPC-2 при 0,25 мкМ. -1 с -1 ; каталитическая эффективность фермента KPC-15 была выше на 2.19-кратное и 2,43-кратное для цефотаксима и азтреонама, со значениями 0,92 и 0,34 мкМ -1 с -1 , соответственно, по сравнению со значениями фермента KPC-2, при 0,42 и 0,14 мкМ -1 с -1 , соответственно, но выше в 2,01 раза для цефазолина со значением 5,62 мкМ -1 с -1 по сравнению с ферментом KPC-2 при 2,8 мкМ -1 с −1 . Количественные значения начальной скорости в зависимости от концентрации субстрата (v 0 / [с]) для ферментов KPC-15 и KPC-2 приведены в таблице S1.В целом каталитическая эффективность KPC-15 была выше, чем у KPC-2 для всех протестированных антибиотиков в этом исследовании (Таблица 3).
Анализ последовательности ПЦР и генетическая организация
Анализ нуклеотидной последовательности из 8997 п.н. для Kp1241 показан на рисунке 3. В последовательности было 5 различных генов, включая гены tnpR , bla TEM-12 и bla KPC-15 , а транспозоны IS Kpn8 и IS Kpn6 -подобны [24].Сайты транскрипционных промоторов для генов bla TEM-12 и bla KPC-15 были обозначены как +1, а также показаны области -10 и -35; однако не было очевидных транскрипционных промоторов в tnpR , IS Kpn8 и IS Kpn6 -подобных транспозонах. Между геном tnpR и транспозоном IS Kpn8 имелся нуклеотидный интервал 109 п.н .; Нуклеотидная последовательность транспозона IS Kpn8 составляла 3020 п.н.Между транспозоном IS Kpn8 и геном bla TEM-12 имелся нуклеотидный интервал 206 п.н., который включал сайт транскрипционного промотора для гена bla TEM-12 , +1 ( g , стартовый кодон), область -10 ( tataac ) и область -35 ( ttattg ). Между генами bla TEM-12 и bla KPC-15 имелся нуклеотидный интервал 223 п.н., который включал сайт транскрипционного промотора для гена bla KPC-15 , + 1 ( g , стартовый кодон), область -10 ( gattac ) и RBS ( aaggaa , сайт связывания рибосомы), но в гене bla KPC-15 не было показано очевидной области -35. .Между геном bla KPC-15 и транспозоном, подобным IS Kpn6 , имелся нуклеотидный интервал 249 п.н., а транспозон, подобный IS Kpn6 , имел нуклеотидную последовательность 1320 п.н.
Фигура 3. Промоторные элементы генов bla KPC-15 и bla TEM в нуклеотидной последовательности длиной 8,997 т.п.н.
Последовательность обеспечивала расположенные выше и ниже участки структурных генов bla KPC-15 .Ген tnpA , расположенный выше гена bla KPC-15 (3020 п.н.), был гомологичен предполагаемому транспозону IS Kpn8 и нижележащему региону bla KPC-15 . Ген (1320 п.н.) был гомологичен предполагаемому транспозону IS Kpn6 -подобному. Нуклеотиды перед кодонами начала трансляции гена bla KPC-15 и bla TEM-12 показаны в рамке. Предполагаемые -10 промоторных элементов гена bla KPC-15 были показаны как gattaa , обозначенные как -10 ниже, и не было обнаружено никаких очевидных -35 промоторных элементов в промоторной области.Предполагаемые элементы -10 и -35 промотора гена bla TEM-12 были показаны как tataac и ttattg , обозначенные как -10 и -35 ниже области промотора. Сайты начала транскрипции обозначены как G с +1 остатком. RBS был аббревиатурой сайта связывания рибосомы.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111491.g003
Обсуждение
В последние годы во многих сообщениях описывалось присутствие β-лактамаз KPC (особенно KPC-2) и обнаружено, что они могут вызывать устойчивость к карбапенему или снижать восприимчивость к карбапенему у штаммов семейства Enterobacteriaceae из разных районы в Китае [5], [16], [32].Похоже, что ферменты KPC становятся широко распространенными в Китае, и плазмиды разных размеров могут нести ген bla KPC-2 [33]. Генетическая среда гена bla KPC была охарактеризована в некоторых исследованиях, и различные транспозонные элементы, по-видимому, ответственны за быстрое распространение bla KPC [33] — [35].
В этом исследовании тесты на чувствительность показали, что штамм Kp1241 показал устойчивость к хинолонам, аминогликозидам и бета-лактамным антибиотикам, но чувствительность к полимиксину B и колистину с МПК 0.5 и 1 мкг / мл (таблица 2) соответственно. Этот результат предполагает, что старые антибиотики, полимиксин B и колистин, могут играть важную роль в лечении штамма Kp1241 [36].
Сравнивая аминокислоты с другими KPC, KPC-15 показал более двух сайтов аминокислотных изменений (A119L и G146 K) и оказался почти гомогенным с KPC-4 (рисунки 1 и 2). Изменения аминокислот будут влиять на кинетические свойства ферментов KPC. Несмотря на разные значения kms и kcats, каталитическая эффективность (kcat / км) KPC-15 была выше, чем у KPC-2, для всех протестированных антибиотиков (таблица 3).Эти данные предполагают, что эффект KPC-15 вызывает более высокую устойчивость к β-лактамным антибиотикам (включая имипенем, меропенем, цефтазидим, цефотаксим, азтреонам и цефазолин), чем KPC-2. Более того, эволюционная трансформация изменила KPC с эффективной карбапенемазы на ее варианты (KPC-15) с лучшей каталитической эффективностью цефтазидимазы. Из-за множественной устойчивости к хинолонам или аминогликозидным антибиотикам, помимо карбапенемазы, штамм Kp1241 может включать другие гены, такие как гены хинолонов или аминогликозидов.
Согласно литературным данным, в Китае существует особая генетическая среда с химерой нескольких транспозон-ассоциированных элементов, таких как Tn 3 , IS Kpn8 и IS Kpn6 -подобный элемент на плазмиде pKP048 [33] . С помощью исследований конъюгации и картирования генов мы получили три плазмиды разной длины. Вариант bla KPC-15 находится на ок. Плазмида размером 73 т.п.н. и несет I SKpn8 и детерминанту IS Kpn6 -подобного элемента [24].Трансформант также был намного менее устойчивым, чем исходный изолят, скорее всего, из-за отсутствия какого-либо повреждения проницаемости. Генетическое окружение гена bla KPC-15 в плазмиде показало структурное и контекстное сходство с характеристиками, обнаруженными в плазмиде pKP048 [33], за исключением усеченного гена bla TEM-12 и bla Вариант KPC-15 был вставлен и расположен между IS Kpn8 и новым вариантом bla KPC-15 [24].Нуклеотиды перед стартовым кодоном трансляции bla KPC-15 также показаны на фиг.3. Стартовый кодон был обозначен как G рядом с остатком +1, а предполагаемые элементы промотора -10 обозначены как gattaa и обозначен как -10 ниже. Эти данные согласуются с исследованием Yigit et al. [8]; однако в промоторной области не было обнаружено очевидной области -35, что отличалось от предыдущего сообщения [8]. В этом исследовании была обнаружена только последовательность длиной 233 п.н. между геном bla TEM-12 и вариантом bla KPC-15 (рис. 3).
Выводы
Исследование показало, что старые антибиотики (полимиксин B и колистин) могут играть роль в терапии. Новый KPC-15 имел более двух сайтов аминокислотных замен (A119L и G146 K) и был практически гомогенен с KPC-4. Каталитическая эффективность KPC-15, вызывающая устойчивость к β-лактамным антибиотикам, была выше, чем у KPC-2. Более того, эволюционная трансформация изменила KPC с эффективной карбапенемазы на ее варианты (KPC-15) с лучшей каталитической эффективностью цефтазидимазы.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить профессора Сен Чжана из больницы Пекинского союза за критическое прочтение рукописи.
Вклад авторов
Задумал и спроектировал эксперименты: DW. Проведены эксперименты: DW JC LY YM YY. Проанализированы данные: DW JC. Участвовал в написании рукописи: DW. Прочитал и утвердил окончательную рукопись: DW JC LY YM YY.
Ссылки
- 1. Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) (2009) Руководство по контролю инфекций, вызываемых устойчивостью к карбапенемам или продуцирующей карбапенемазы Enterobacteriaceae в учреждениях неотложной помощи.MMWR Morb Mort Wkly Rep 58: 256–260.
- 2. Цао В.Б., Арлет Дж., Эрикссон Б.М., Таммелин А., Курвалин П. и др. (2000) Появление устойчивости к имипенему у Klebsiella pneumoniae из-за комбинации плазмид-опосредованного CMY-4 и изменения проницаемости. J Antimicrob Chemother 46: 895–900.
- 3. Wieczorek P, Sacha P, Hauschild T, órawski M, Krawczyk M, et al. (2008) Acinetobacter baumannii с множественной лекарственной устойчивостью — роль оттока AdeABC (семейство RND) в устойчивости к антибиотикам.Folia Histochem Cytobiol 46: 257–267.
- 4. Neuwirth C, Siébor E, Duez JM, Péchinot A, Kazmierczak A (1995) Устойчивость к имипенему в клинических изолятах Proteus mirabilis , связанная с изменениями в пенициллин-связывающих белках. J Antimicrob Chemother 36: 335–342.
- 5. Nordmann P, Cuzon G, Naas T (2009) Реальная угроза Klebsiella pneumoniae бактерий, продуцирующих карбапенемазу. Lancet Infect Dis 9: 228–236.
- 6.Poirel L, Héritier C, Tolun V, Nordmann P (2004) Появление опосредованной оксациллиназой устойчивости к имипенему у Klebsiella pneumoniae . Антимикробные агенты Chemother 48: 15–22.
- 7. Walther-Rasmussen J, Høiby N (2007) Карбапенемазы класса А. Журнал Antimicrob Chemother 60: 470–482.
- 8. Yigit H, Queenan AM, Anderson GJ, Domenech-Sanchez A, Biddle JW и др. (2001) Новая гидролизующая карбапенем бета-лактамаза, KPC-1, из устойчивого к карбапенему штамма Klebsiella pneumoniae .Антимикробные агенты Chemother 45: 1151–1161 (Erratum 52: 809) ..
- 9. Смит Моланд Э., Хансон Н. Д., Эррера В. Л., Блэк Дж. А., Локхарт Т. Дж. И др. (2003) Плазмидопосредованная бета-лактамаза, гидролизующая карбапенем, KPC-2, в изолятах Klebsiella pneumoniae . Журнал Antimicrob Chemother 51: 711–714.
- 10. Yigit H, Queenan AM, Rasheed JK, Biddle JW, Domenech-Sanchez A, et al. (2003) Устойчивый к карбапенемам штамм Klebsiella oxytoca , несущий гидролизирующую карбапенем бета-лактамазу KPC-2.Антимикробные агенты Chemother 47: 3881–3889.
- 11. Miriagou V, Tzouvelekis LS, Rossiter S, Tzelepi E, Angulo FJ, et al. (2003) Устойчивость к имипенему в клиническом штамме Salmonella из-за плазмид-опосредованной карбапенемазы класса A KPC-2. Антимикробные агенты Chemother 47: 1297–1300.
- 12. Woodford N, Tierno PM, Jr Young K, Tysall L, Palepou MF и др. (2004) Вспышка Klebsiella pneumoniae , продуцирующая новую гидролизирующую карбапенем бета-лактамазу класса A, KPC-3, в Медицинском центре Нью-Йорка.Антимикробные агенты Chemother 48: 4793–4799.
- 13. Palepou MF, Woodford N, Hope R, Colman M и др .. (2005) Новая карбапенемаза класса A, KPC-4, в изоляте Enterobacter из Шотландии, abstr. 1134–01–20. Прог. Abstr. 15 th Eur. Конг. Clin Microboil Infect Dis, Копенгаген, Дания.
- 14. Maltezo HC (2009) Металло-β-лактамазы у грамотрицательных бактерий: вводя эру множественной устойчивости? Int J Antimicrob Agents 33: 405e.1–405e.7.
- 15. Навон-Венеция С., Хмельницкий И., Ливитт А., Швабер М.Дж., Шварц Д. и др. (2006) Плазмид-опосредованный имипенем-гидролизующий фермент KPC-2 среди нескольких устойчивых к карбапенему клонов Escherichia coli в Израиле. Антимикробные агенты Chemother 50: 3098–3101.
- 16. Queenan AM, Bush K (2007) Карбапенемазы: универсальные β-лактамазы. Clin Microbiol Rev 20: 440–458.
- 17. Sacha P, Zórawski M, Hauschild T, Wieczorek P, Jaworowska J, et al.(2007) Присутствие bla IMP генов на плазмидной ДНК, выделенной из штаммов Pseudomonas aeruginosa с множественной лекарственной устойчивостью, в Университетской больнице в Белостоке (Польша) — первое сообщение. Folia Histochem Cytobiol 45: 405–408.
- 18. Deshpande LM, Rhomberg PR, Sader HS, Jones RN (2006) Появление сериновых карбапенемаз (KPC и SME) среди клинических штаммов Enterobacteriaceae , выделенных в медицинских центрах США: отчет программы MYSTIC (1999–2005).Диагностика Microbiol Infect Dis 56: 367–372.
- 19. Sacha P, Wieczorek P, Hauschild T, Zórawski M, Olszañska D, et al. (2008) Металло-β-лактамазы Pseudomonas aeruginosa — новый механизм устойчивости к β-лактамным антибиотикам. Folia Histochem Cytobiol 46: 137–142.
- 20. Hawkey PM, Jones AM (2009) Изменяющаяся эпидемиология устойчивости. J Antimicrob Chemother 64: i3 – i10.
- 21. Wolter DJ, Kurpiel PM, Woodford N, Palepou M-FI, Goering RV и др.(2009) Фенотипический и ферментативный сравнительный анализ нового варианта KPC KPC-5 и его эволюционных вариантов, KPC-2 и KPC-4. Антимикробные агенты Chemother 53: 557–562.
- 22. Робледо И.Е., Акино Е.Е., Санте М.И., Сантана Д.Л., Д.М. Отеро и др. (2010) Обнаружение KPC в Acinetobacter spp . в Пуэрто-Рико. Антимикробные агенты Chemother 54: 1354–1357.
- 23. Китчел Б., Рашид Дж. К., Патель Дж. Б., Сринивасан А., Навон-Венеция С. и др. (2009) Молекулярная эпидемиология KPC-продуцирующих изолятов Klebsiella pneumoniae в США: клональная экспансия мультилокусной последовательности типа 258.Антимикробные агенты Chemother 53: 3365–3370.
- 24. Ван Д., Хоу В., Чен Дж., Моу И., Ян Л. и др. (2014) Характеристика генов bla KPC-2 и bla KPC-3 и нового гена bla KPC-15 в Klebsiella pneumoniae . J Med Microbiol 63: 981–987.
- 25. CLSI (2012) Стандарты эффективности тестирования чувствительности к противомикробным препаратам; двадцать первое информационное приложение.Clin Lab Stand Inst M100 – S22, 31.
- 26. Ван М., Тран Дж. Х., Якоби Г. А., Чжан Ю., Ван Ф. и др. (2003) Опосредованная плазмидами устойчивость к хинолонам в клинических изолятах Escherichia coli из Шанхая, Китай. Антимикробные агенты Chemother 47: 2242–2248.
- 27. Лин С., Томас М., Шлаес Д. М., Рудин С. Д., Нокс Дж. Р. и др. (1998) Кинетический анализ резистентного к ингибитору варианта β-лактамазы OHIO-1, фермента класса A семейства SHV. Biochem J 333: 395–400.
- 28. Томсон Дж. М., Дистлер А. М., Бономо Р. А. (2007) Преодоление устойчивости к ингибиторам β-лактамазы: сравнение сульбактама с новыми ингибиторами против резистентных к клавуланату ферментов SHV с заменами в позиции Амблера 244. Биохимия 46: 11361–11368.
- 29. Папп-Уоллак К.М., Бетел CR, Дистлер А.М., Касубоски С., Тарасила М. и др. (2010) Устойчивость к ингибиторам β-актамазы KPC-2: выдающееся свойство β-лактамазы класса А. Антимикробные агенты Chemother 54: 890–897.
- 30. Frere JM, Dormans C, Duyckaerts C, De Graeve J (1982) Взаимодействие β-йодопеницилланата с β-лактамазами Streptomyces albus G и Actinomadura R39. Biochem J 207: 437–444.
- 31. Матань А., Ледент П., Монне Д., Фелиси А., Жамин М. и др. (1995) Кинетическое исследование взаимодействия между BRL 42715, β-лактамазами и D-аланил-D-аланинпептидазами. Противомикробные агенты Chemother 39: 227–231.
- 32. Mendes RE, Bell JM, Turnidge JD, Yang Q, Yu Y и др.(2008) Устойчивые к карбапенемам изоляты Klebsiella pneumoniae в Китае и обнаружение конъюгированной плазмиды ( bla KPC-2 плюс qnrB4 ) и гена bla IMP-4 . Антимикробные агенты Chemother 52: 798–799.
- 33. Шен П, Вэй З, Цзян И, Ду Икс, Джи С. и др. (2009) Новая генетическая среда гидролизующей карбапенем бета-лактамазы KPC-2 среди Enterobacteriaceae в Китае. Антимикробные агенты Chemother 53: 4333–4338.
- 34. Naas T, Nordmann P, Vedel G, Poyart C (2005) Плазмид-опосредованный карбапенем-гидролизующий бета-лактамазу KPC в изоляте Klebsiella pneumoniae из Франции. Антимикробные агенты Chemother 49: 4423–4424.
- 35. Wu Q, Zhang YB, Han LZ, Sun JY, Ni YX (2009) Плазмида опосредует метилазы 16 S рРНК в изолятах Enterobacteriaceae , устойчивых к аминогликозидам, в Шанхае, Китай. Антимикробные агенты Chemother 53: 271–272.
- 36.Заваски А.П., Голдани Л.З., Ли Дж., Нация Р.Л. (2007) Полимиксин B для лечения патогенов с множественной лекарственной устойчивостью: критический обзор. J Antimicrob Chemother 60: 1206–1215.
соревнований | kpc-new
Награды за ежедневную работу. Признание лучшим в своей профессии. Все это возможно через программы Kansas Professional Communicators.
Коммуникатор достижений
За золотом! Каждый год KPC выбирает члена в качестве лица, сообщающего о достижениях.Это наша высшая честь за вклад в индустрию связи. После этого победитель имеет право участвовать в соревнованиях на национальном уровне. Гвен Ларсон из Америкуса, изображенная слева с президентом Дженни Латцке, была нашим лауреатом в 2013 году на конференции в Манхэттене.
Совет директоров Kansas Professional Communicators выберет одного кандидата для представления NFPW. Все кандидаты должны быть действующими участниками с хорошей репутацией в течение не менее двух лет в филиале и NFPW.Если вам нужно проверить статус участника, напишите по адресу [email protected].
Критерии судейства NFPW учитывают следующее:
60 процентов судейства основано на профессиональных достижениях. Все кандидаты должны иметь высокую профессиональную квалификацию и достижения в своей области коммуникаций (например, связи с общественностью, газеты, журналы, реклама, внештатный писатель, редактирование, электронные СМИ или любая другая область, в которой кандидат квалифицирован для членства в NFPW).
20 процентов судейства основано на общественных работах. Каждый кандидат должен был оказать какое-то влияние на мир за пределами своей профессии — какой-то вклад в человечество. Это влияние или вклад может быть через профессию или за ее пределами.
20 процентов судейства основано на NFPW и партнерской службе. Каждый кандидат должен был внести определенный и важный вклад в свою аффилированную организацию и в NFPW.
Скачать форму номинации
COA Стул: Cheryl Miller
Конкурс коммуникаций
Ежегодно участники и не члены выставляют свои лучшие работы в ежегодном конкурсе коммуникаций KPC, который предлагает сотни категорий для письма, работы с общественностью, рекламы, разработки веб-сайтов, электронных средств массовой информации, фотографии, книг, исследований и многого другого.
победителей отмечаются за свои достижения на банкете награждения, который завершает ежегодную весеннюю конференцию KPC. В этом году конференция состоится на Манхэттене.
Дополнительная информация с веб-сайта Национальной федерации женщин, работающих в сфере прессы:
Конкурс коммуникаций 2018 NFPWуже в прямом эфире!
Ежегодный конкурс коммуникаций NFPW уже начался! Кликните сюда, чтобы узнать больше.
Несколько напоминаний:
Ваша работа должна быть опубликована с 1 января 2017 г. по 31 декабря 2017 г.
Вы должны подать заявку или заявки на участие в конкурсе государственного филиала или расширенного сообщества. Если ваша заявка получит первое место, она будет переведена в конкурс национального уровня.
Если вы решили продвигать свою заявку или заявки на участие в конкурсе национального уровня, помните, что вы и все ваши соавторы ДОЛЖНЫ быть NFPW и аффилированными членами.
Многие аффилированные лица позволяют лицам, не являющимся членами, принимать участие в своих соревнованиях. Однако национальный уровень конкурса требует, чтобы вы стали членом NFPW и аффилированным лицом.
Мы с нетерпением ждем конкурса этого года и готовы изучить замечательные работы, которые наши участники опубликовали в 2017 году!
β-лактамаза KPC-2 обеспечивает устойчивость к карбапенемным антибиотикам за счет быстрого деацилирования ковалентного промежуточного соединения
https: // doi.org / 10.1074 / jbc.RA120.015050Получить права и контентСериновые β-лактамазы активного центра гидролизуют β-лактамные антибиотики путем образования ковалентного промежуточного ацил-фермента с последующим деацилированием через активированной молекулы воды. Карбапенемные антибиотики плохо гидролизуются большинством β-лактамаз из-за медленного гидролиза промежуточного продукта ацил-фермента. Однако появление карбапенемазы KPC-2 привело к широко распространенной устойчивости к этим препаратам, что позволяет предположить, что она действует более эффективно.Здесь мы исследовали необычные особенности KPC-2, которые обеспечивают такое сопротивление. Мы показываем, что KPC-2 имеет скорость деацилирования в 20000 раз выше по сравнению с обычной β-лактамазой ТЕМ-1. Более того, кинетический анализ мутантов аланина в активном центре показывает, что гидролиз карбапенема представляет собой согласованное усилие с участием нескольких остатков. Замена Asn170 значительно снижает скорость деацилирования, но этот остаток сохраняется как в KPC-2, так и в β-лактамазах, не являющихся карбапенемазой, что позволяет предположить, что он способствует гидролизу карбапенема только в контексте KPC-2.Рентгеноструктурное определение фермента N170A в комплексе с гидролизованным имипенемом предполагает, что Asn170 может предотвращать инактивацию деацилирующей воды 6α-гидроксиэтильным заместителем карбапенемов. Кроме того, остаток Thr235, который взаимодействует с C3-карбоксилатом карбапенемов, также вносит большой вклад в реакцию деацилирования. Напротив, мутация остатков Arg220 и Thr237 снижает скорость ацилирования и, как это ни парадоксально, улучшает аффинность связывания карбапенемов. Таким образом, роль этих остатков может заключаться в дестабилизации основного состояния комплекса фермент-субстрат или, альтернативно, в обеспечении надлежащего выравнивания субстрата с ключевыми каталитическими остатками для облегчения ацилирования.Эти данные предполагают модификации каркаса карбапенема, чтобы избежать гидролиза бета-лактамазой KPC-2.
Ключевые слова
устойчивость к антибиотикам
ферментный катализ
кинетика фермента
структура белка
микробиология
ферментный механизм
Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)
© 2020 Авторы. Опубликовано Elsevier Inc от имени Американского общества биохимии и молекулярной биологии.
Рекомендуемые статьи
Ссылки на статьи
Поисковые организации | Выбирать.Нажмите.
О нас
Kenai Peninsula College стремится к совершенству в образовании, обучении и обучении на протяжении всей жизни, предлагая доступные возможности в благоприятной среде. Мы являемся представителем Университета Аляски в Анкоридже на полуострове Кенай и стремимся обеспечить лучшую образовательную ценность за ваш доллар в любом месте. KPC предлагает частный колледж по цене государственного университета в кампусе Kenai River в Солдотне, кампусе Kachemak Bay в Гомере, сайте расширения Resurrection Bay в Сьюарде и сайте расширения Anchorage.Кампус Kenai River в Солдотне предлагает общежитие (92 места) и Центр карьеры и технического образования.
How Pick.Click.Give. имеет значение
Пожертвования Колледжу полуострова Кенай имеют жизненно важное значение для обеспечения того, чтобы мы могли продолжать предоставлять высококачественное образование и обучение, которыми мы известны. KPC прилагает все усилия, чтобы найти альтернативные источники финансирования в дополнение к государственному финансированию, выделенному штатом Аляска Университету Аляски. Многие пожертвования направляются на студенческие стипендии или выделенные стипендии, которые финансируют стипендии на неограниченный срок за счет полученных инвестиционных долларов.Некоторые доноры указывают, что их взносы будут направлены на конкретные академические программы, финансирование репетиторов или программ обучения грамоте и развитию. Другими областями, поддерживаемыми пожертвованиями, являются специальные программы, спонсируемые колледжем, такие как Конференция писателей залива Качемак, Академия рыболовства Кенай, Семестр у залива, Обучение работе для молодежи, Молодежь для понимания международного студенческого обмена и серия презентаций KPC по гуманитарным наукам. У KPC есть учебные центры в кампусах Кенай-Ривер и Качемак-Бэй, которые предоставляют репетиторство / тестирование GED и базовое образование для взрослых, и оба в значительной степени полагаются на гранты и пожертвования для обеспечения персонала и учебных ресурсов.Пожертвования также могут быть направлены на мероприятия и конференции по профессиональному развитию преподавателей и сотрудников, чтобы убедиться, что они не отстают от новейших технологий и процессов, обеспечивающих максимальную пользу для студентов и учреждения. Библиотеки KPC также получают большую выгоду от пожертвований, которые помогают им приобретать книги, подписку на базы данных в Интернете и другие справочные материалы. Некоторые факультеты требуют постоянного обновления оборудования, чтобы студенты получали наиболее подходящее образование.Программы KPC для фельдшеров и медсестер являются прекрасными примерами программ на получение степени, которые требуют постоянной оценки оборудования, а пожертвования помогают поддерживать такие виды покупок. Сложные симуляторы человеческого тела позволяют инструкторам представлять учащимся сложные метаболические сценарии, которые помогают им приобрести навыки, которые они не смогли бы освоить никаким другим способом, кроме практики на пациентах. Студентам сварочного отделения KPC предоставляются вытяжки с подачей свежего воздуха с избыточным давлением, которые не позволяют им вдыхать пары, образующиеся при обучении сварочному искусству.Вытяжки требуют периодического обновления и замены, чтобы обеспечить адекватную защиту учащихся, и пожертвования могут помочь в этом.